材料和试剂

3×4细胞培养多孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：150628）
parafilm
剃刀刀片
玻璃载玻片（75×38mm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：12-550B）
盖玻片（18×18mm）（厚度：0.17mm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S17521）
拟南芥野生型（哥伦比亚生态型），dnd1突变体（At5g15410），clv3突变体（At2g27250）
合成的CLV3肽RTVP p SGP DPLHH ^{3（GenScript，Piscataway，NJ）}
Murashige和Skoog盐（MS）（Caisson Laboratories，目录号：MSP01-10LT）
氯化钆（III）（GdCl 3）（Sigma-Aldrich，目录号：439770）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459836）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：SO389）
MES缓冲液（pH 5.7）（Caisson Laboratories，目录号：M009-100GM）
灭菌水
Tris（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
乙酸（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：A38S-500）
水合氯醛（Sigma-Aldrich，目录号：C8383）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：17904）
植物培养基（见配方）
固定解决方案（参见配方）
清除解决方案（参见配方）

设备

冰箱
振动器
用于生长植物的生长室（100μmolm-2 sec -1白光16小时，黑暗8h，23℃）。
镊子
解剖显微镜
配备有Nomarski光学器件的显微镜（Nikon Instrument，型号：MICROPHOT-FX）。

软件

无限分析程序（Lumenera，Ottawa，Canada）。

程序

拟南芥幼苗培养和处理
1. 向多孔板的每个孔中加入2ml 1/2MS液体培养基。
2. 对所有种子进行表面消毒，并将1粒种子置于多孔板的每个孔中
3. 通过将多孔板在4℃放置3天以打破休眠来分层种子。
4. 分层后，将多孔板从4℃冰箱中取出，并对每个孔添加不同的处理。在我们的实验中，我们添加单独的CLV3配体（1μM终浓度），Ca 2+通道阻断剂GdCl 3单独（150μM终浓度）和CLV3与GdCl _{注意：因为CLV3肽溶解在水中，所以对照组应该是水，并且应当是与CLV3处理组相同的量。加入的少量水（在我们的实验中为2μl）不应该对幼苗具有任何渗透胁迫。</em>}
5. 将含有幼苗的多孔板放置在生长室（100μmol/cm 2）中的旋转振荡器（180rpm）上16小时和黑暗在8小时，23℃）。我们将这一天定义为实验的开始日期（第0天）。
幼苗准备解剖
1. 在生长室中生长7天后，用镊子从多孔板中一次取出一个幼苗，并将其放在一张纸巾上3秒钟以吸收过量的培养基。
2. 用镊子从纸巾中取出单个幼苗，并将其侧向放置在解剖显微镜下的一块石蜡膜上。
3. 用锋利的刀片去除根，子叶和最古老的叶原基。
4. 为了防止形态变化，快速（但轻轻地）用镊子将切开的组织移动到仅含新鲜制备的固定溶液的同一板的孔中，并在室温下孵育过夜。
5. 第二天清除固定溶液，更换为90％乙醇。将板在室温下振荡器上放置1小时（40rpm）。
6. 除去90％乙醇，更换为70％乙醇。将板放在振荡器上在室温下长达1小时（40rpm）
7. 从70％乙醇中一次取出一个切开的组织，并放置在载有一滴新鲜制备的澄清溶液的载玻片上。
8. 在配有Nomarski光学显微镜（MICROPHOT-FXA;尼康，日本东京）下观察。
  注意：清除溶液的反应是快速（〜5分钟）。最好一次查看1到2个样品，并在显微镜下观察SAM时拍摄照片。一段时间后，SAM的圆顶将难以与周围组织区分开。在显微镜下观察之前，其余的幼苗可以保持在70％乙醇中。
SAM面积测量。
1. Open Infinity分析软件程序。
2. 选择"捕获"拍摄照片。在对应于SAM的中间光学截面的焦平面处记录单个幼苗图像
3. 在两个相对的叶原基的底部边缘之间画一条直线在SAM圆顶的每一边。这条线代表SAM圆顶的底部（图1）。产生垂直线，将SAM基底的中点连接到SAM圆顶的顶部（图1C）。
4. 选择"区域周长"进行SAM尺寸测量。根据步骤C3中描述的两条线，通过徒手绘制围绕封闭的SAM形状区域。通过计算表示SAM的基底的宽度的直线上方的面积来确定SAM的面积。程序将自动计算面积和周长。
  
  图1.装备有Nomarski光学的显微镜下的7-d-old拟南芥 SAM区域。 A.野生型。 B缺失突变体缺失功能性环核苷酸门控阳离子通道同种型2（CNGC2）多肽和（C）clv3突变体。黄色三角形表示SAM圆顶的基边。连接2个黄色三角形的红线表示SAM圆顶的底部。垂直红线将SAM基座的中点连接到SAM圆顶的顶部。

数据分析

为了比较野生型，dnd1 和 clv3 突变体幼苗的SAM大小（参见图1和图2A），测量了每种基因型的至少15个幼苗。对于野生型中的内源性CLV3（图2B）和外源CLV3对clv3突变体的影响的钙通道阻断剂效应，对每种处理测量至少10个秧苗（图2C）。使用ANOVA分析来评估平均值分离。对于图2A和2B，在代表基因型或治疗的条上的星号或两个星号表示SAM大小显着不同（在P <0.05或 P <0.01），分别）比对照（WT）。对于图2C，ANOVA比较用括号表示

图2. Ca ^{2 +}信号与SAM区域的CLV3控制相互作用。（a）。 7-d-old WT，dnd1 和 clv3 幼苗的SAM区。（b）。在第3天或第0天（实验开始的当天）在标准1/2MS液体培养基（对照）或补充有Gd 3+ + /μM的培养基上生长的WT幼苗。（C）。用水（对照），CLV3或CLV3和Gd 3+处理在标准培养基上生长的幼苗。 CLV3和Gd <3> 。使用ANOVA分析评估平均值分离。图2所示的所有幼苗是7日龄幼苗。对于（a）和（b），表示基因型或处理的条上方的星号或两个星号表明SAM大小显着不同（在P <0.05或< < 0.01）。对于（c），ANOVA比较用括号表示。

食谱

植物培养基
在200ml MiliQ水中溶解2g蔗糖，0.433g 1/2 MS盐和2ml MES，然后用Tris调节pH至5.7。高压灭菌器
固定解决方案
乙酸：无水乙醇（1:9，v/v）
清除解决方案
水合氯醛，甘油和水（8：1：2，w/v/v）

致谢

这项工作是由国家科学基金会奖1146827（到G.A.B）支持。该方案从Fiers等人（2006），Ohyama等人（2009），Carles等人改编和修改。，（2010）和Miguel Aguilar博士。

参考文献

Aguilar M. 识别突变种子的特征使用nomarski显微镜（基因一）
Carles，C.C.，Ha，C.M.，Jun，J.H.，Fiume，E。和Fletcher。 JC（2010）。分析茎尖分生组织发育。/a> Plant Development Biol 655：105-29。
Fiers，M.，Golemiec，E.，Schors，R.，Van，Der。，Geest，L.，Van，D.，Li，KW，Stiekema，WJand Liu，CM（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16751438"target ="_ blank"> CLAVATA3的CLAVATA3/ESR基序在功能上与非保守侧翼序列无关。/a> Plant Physiol 141（4）：1284-1292
Ohyama，K.，Shinohara，H.，Ogawa-Ohnishi，M.and Matsubayashi，Y。（2009）。拟南芥中的糖肽调节干细胞命运。 Natal Biol Biol 5（8）：578 -580。