材料和试剂

15ml无菌锥形管（Corning，目录号：430055）
50ml无菌锥形管（Corning，目录号：430829）
微滑玻璃（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：22-230-900）
0.22μm注射器过滤器（Pall，目录号：PN4192）
脐带血源性间充质干细胞（从脐静脉采集新生儿脐带血，并通知母体同意。对于UCB收集，将16号针插入脐静脉，并且通过重力使UCB流动。 Yang等人[2004]关于细胞分离和维持的方案）
最小必需培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12571）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水，无钙&镁（Mediatech，目录号：21-031-CVR）
TrypLE TM超高速缓冲液酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12605）
4％多聚甲醛溶液（Biosesang，目录号：P2031）
乙醇
DAKO EnVisionSystem过氧化物酶（DAB）试剂盒（Agilent Technologies，目录号：K4006）
DAKO Protein block，无血清（Agilent Technologies，目录号：X0909）
II型胶原抗体（EMD Millipore，目录号：MAB8887，抗体稀释度1:100）
X型胶原抗体（Thermo Fisher Scientific，Invirtrogen，目录号：MA5-14268，抗体稀释度1:100）
RUNX2抗体（Abcam，目录号：ab76956，抗体稀释度1：1500）
磷酸-GSK-3β（Ser9）的抗体（Cell Signaling Technology，目录号：5558，抗体稀释度1:1000）
β-联蛋白的抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9582，抗体稀释度1:1000）
磷-SMad1（Ser206）的抗体（Cell Signaling Technology，目录号：5753，抗体稀释度1:1000）
GAPDH抗体（Abcam，目录号：ab9485，抗体稀释度1:4000）
Tris-HCl
BSA
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
Mayer的苏木精（安捷伦科技公司，目录号：S3309）
Shandon二甲苯替代品（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：6764506）
Shandon二甲苯底物封固剂（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：9999122）
胎牛血清，认证级，美国产地（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：16000-044）
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15750）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11965）
BMP-6（R& D Systems，目录号：507-BP-020/CF）
TGF-β3（R& D Systems，目录号：243-B3-002/CF）
ITS +（Corning，目录号：354352）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A8960）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D2915）
L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P5607）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P8574）
三碘甲状腺原氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T6397）
Runx2的引文
正向5'-CGG AGT GGA TGA GGC AAG AG-3'
反向5'-GGC TCA GGT AGG AGG GGT AA-3'
GAPDH的入门
正向5'-CTT CTT TTG CGT CGC CAG CCG A-3'
反向5'-TGG CCA GGG GTG CTA AGC AGT-3'
完成培养基（见配方）
体外软骨形成诱导培养基（参见配方）
体外肥大诱导培养基（参见食谱）

设备

175T烧瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：159910）
带有摆动斗转子和适配器的离心机用于15 ml锥形管
将加湿的细胞培养箱设定为37℃和5％CO 2/h
血细胞计数器（VWR，INCYTO C-Chip TM ，目录号：DHCN015）
低温恒温器（Leica Biosystems Nussloch，型号：CM1850）
OCT化合物（VWR，Tissue-Tek ，目录号：25608-930）
用于免疫组织化学染色图像分析的显微镜（具有DS-Fi1数字显微镜照相机头的Nikon ECLIPSE 50i）（Nikon Instruments，型号：ECLIPSE 50i）

软件

ImageJ程序

程序

电镀细胞增殖
1. 在具有完全培养基（50ml）的175T烧瓶中种子5000个间充质干细胞/cm 2。
2. 第二天，用新鲜的完全培养基替换一半培养基（25ml）。
3. 每2-3天更换培养基与新鲜最低必需培养基α培养基，直到细胞至少70-80％汇合。
4. 在70-80％融合时，用DPBS洗涤细胞一次，然后用TrypLE TM Suppress Express酶分离细胞。
诱导体外软骨形成
1. 对于软骨形成程序，用30ml的体外软骨形成诱导培养基（不含BMP-6，TGF-β3和ITS +）在50ml管中洗涤细胞两次。为了洗涤，在室温下将悬浮细胞在500ml管中以500×g离心5分钟。
2. 使用血球计数器计数细胞
3. 将细胞用体外软骨诱导介质悬浮在15ml试管中，终浓度为2×10 5/u /400μl。
4. 在室温下以500×g离心5分钟，将细胞在15ml管中离心。
5. 小心不摇动试管，用培养箱中的体外软骨诱导培养基培养细胞沉淀。松开用于气体交换的管帽，并保持管直立（图1）。
6. 在体外软骨形成诱导培养基中将细胞沉淀物培养2周。用新鲜的体外软骨形成诱导培养基每周两次更换培养基（3天后更换培养基，4天后更换培养基）。
  
  图1.在CO 2培养箱中使用15ml管的沉淀培养物。离心后，将15ml管小心地移至CO 2/>孵化器。在培养期间，15ml试管应使用锥形管架直立放置
诱导体外肥大
1. 对于肥大诱导，用体外的肥大诱导培养基洗涤细胞沉淀两次
2. 将400μl新鲜的体外增殖诱导培养基加入15ml管中
3. 用体外培养的肥大诱导培养基培养细胞沉淀2周。每周两次用新鲜的体外增强诱导培养基替换培养基（3天后第一次培养基更换，4天后第二次培养基更换）。
免疫组织化学分析
1. 使用DPBS洗涤细胞沉淀，并使用4％多聚甲醛溶液在室温下固定2小时。
2. 在-20℃下冻存OCT化合物中的细胞沉淀。切成5μm厚的低温恒温器切片并置于带电玻璃微滑片上。
3. 冷冻切片在乙醇中脱水10分钟，并简单地浸入蒸馏水中以除去OCT化合物
4. 为了阻断过氧化物酶的活性，应用足够的过氧化物酶封闭溶液（DAKO DAB试剂盒的组分）覆盖标本并在室温下孵育5分钟。用蒸馏水轻轻冲洗。
5. 为了阻断非特异性抗体结合位点，应用足够的蛋白质封闭溶液覆盖标本，并在室温下孵育30分钟。用蒸馏水轻轻冲洗。
6. 洗涤后，将载玻片在4℃下与在含有1％BSA的0.05M Tris-HCl中稀释的针对X型胶原蛋白的一抗孵育过夜。
7. 用500ml DPBS（含有0.1％Tween 20）用染色罐洗涤载玻片10分钟。重复一次。
8. 应用足够的标记聚合物HRP抗小鼠溶液（DAKO DAB套件的组件）覆盖标本，并在室温下孵育30分钟。
9. 用500ml DPBS（含有0.1％Tween 20）用染色罐洗涤载玻片10分钟。重复一次。
10. 用500ml DPBS用染色罐洗涤载玻片10分钟。重复一次。
11. 施用足够的DAB +色原溶液（DAKO DAB试剂盒的组分）以覆盖样品
12. 用蒸馏水轻轻冲洗。
13. 对于逆染色，应用足够的苏木精溶液覆盖标本并孵育1分钟
14. 使用染色罐用500ml蒸馏水洗涤载玻片2分钟。重复两次。
15. 使载玻片在70％，95％和100％乙醇中连续脱水1分钟。
16. 将载玻片置于100％乙醇中2分钟，重复一次。
17. 将幻灯片放在Shandon Xylene Substitute中2分钟，然后重复两次。
18. 使用Shandon二甲苯底物Mountant安装载玻片。

数据分析

在体外软骨形成诱导的MSC中，软骨形成分化状态容易通过颗粒大小估计。在软骨形成和肥大诱导条件下28天后，我们使用mm刻度尺测量小球的尺寸（图2）。软骨形成分化的（左，图2）和肥厚分化的（右，图2） 1mm，直径尺寸为0.7-0.8mm。我们的研究结果表明，肥厚分化的沉淀小于软骨形成分化的MSCs的沉淀。

图2.丸粒尺寸比较。将UCB-MSC的左侧沉淀在体外软骨形成诱导培养基中培养4周。将右小丸在体外软骨形成诱导培养基中培养2周，并在体外增殖诱导培养基中连续培养2周。图片的下部显示mm刻度尺的刻度。

为了检查在每种条件下颗粒的肥大诱导，我们通过免疫组织化学染色检测X型胶原的表达（图3）。在软骨形成诱导条件下获得的颗粒显示对X型胶原抗体的弱阳性反应性（图3A）。在肥大诱导培养基中培养的沉淀显示暗褐色，表明X型胶原的高表达水平（图3B）。总之，我们可以观察到在肥大分化的沉淀中X型胶原蛋白的更高表达

为了验证hUCB-MSC中肥大的诱导，将切片切片并通过免疫组织化学染色检测X型胶原蛋白的表达。 A. 4周，将沉淀诱导成软骨形成分化。 B.在软骨形成分化2周后，将沉淀诱导为肥大分化2周。比例尺= 250μm。

对于肥大诱导的其他验证，我们使用蛋白质印迹和RT-PCR（图4）评估了肥大标记物，表达相关的转录因子2（Runx2）的表达。在肥大诱导条件下，成骨转录因子Runx2的蛋白质和mRNA表达水平分别是软骨形成诱导条件下的沉淀中的2.4倍和3.1倍。使用ImageJ程序定量Runx2的表达

为了验证UCB-MSC中的肥大分化，使用蛋白质印迹（A）和逆转录酶聚合酶链反应（A）来评估转录因子Runx2的表达。 B）。

为了表征与我们的协议肥厚诱导相关的信号通路，我们评估磷酸化（p）GSK-3β，β-连环素和pSMAD1在WNT /β-连环蛋白和TGF-β/BMP成骨信号通路中的表达使用西方印迹（图5）。在肥大分化的小丸中，pGSK-3β表达比软骨形成诱导条件下的小丸高3.6倍。 β-连环蛋白和pSMAD1表达水平分别比软骨形成分化的小丸中的高2.1倍和2.8倍。使用ImageJ程序定量每种蛋白质的表达

图5.hUCB-MSC的肥大分化过程中的成骨信号传导途径。在肥大培养后，收获并裂解沉淀。通过Western印迹分析GSK-3β，β-连环蛋白和SMAD1的表达。

笔记

如果观察到较低的球粒肥大程度，则在体外诱导的肥大中增加洗涤步骤的数量。
在生产后两个月内使用新鲜的ITS +补充剂。
避免T3的反复冻融。

食谱

完全培养基（制备的培养基可以在4℃保持2周）
Minimium essential medium-alpha
10％胎牛血清（FBS）
50μg/ml庆大霉素
体外软骨形成诱导培养基（立即使用准备的培养基用于细胞因子活性）
500ml Dul becco改良的Eagle培养基）
500ng/ml BMP-6
10ng/ml TGF-β3 1％ITS +
50μg/ml抗坏血酸
0.6μg/ml地塞米松 40μg/ml L-脯氨酸 100μg/ml丙酮酸钠 50μg/ml庆大霉素
体外肥大诱导培养基（立即使用准备的培养基用于细胞因子活性）
ulbecco改良的Eagle培养基（DMEM培养基） 500ml
致谢

该协议从我们先前的工作（Jeong等人，2015）和Jason A.Burdick小组（Bian等人，2012）的方法修改并且得到支持国家研究基金会（2015M3D6A1065098）。

参考文献
1. Bian，L.，Zhai，DY，Zhang，EC，Mauck，RL和Burdick，JA（2012）。 1）：116-128
2. Jeong，SY，Ha，J.，Lee，M.，Jin，HJ，Kim，DH，Choi，SJ，Oh，W.，Yang，YS，Kim，JS，Kim，BG，Chang，JH，和Jeon，HB（2015）。血小板反应蛋白的自分泌作用-2确定软骨形成细胞分化潜能并抑制人脐带血源性间充质干细胞的肥大成熟。干细胞 33（11）：3291-3303。