材料和试剂

ThermoGrid ^TM刚性条带0.2-ml PCR管（Denville Scientific，目录号：C18064 [1000859]）
Posi-Click 1.7-ml微量离心管（Denville Scientific，目录号：C2171）
1.5 ml管子
10厘米的菜肴
NucAway旋转柱（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM10070）}
一次性比色皿，1.5毫升（Stockwell Scientific，目录号：2410）
无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9930）
从总RNA制备的cDNA
DreamTaq DNA聚合酶（5U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EP0701）}
dNTP混合物（每种10mM）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：R0193）}
Agarose LE（Denville Scientific，目录号：CA3510-8）
QIAquick凝胶提取试剂盒（50）（QIAGEN，目录号：28704）
MEGAshortscriptTM T7试剂盒，手册（RNA短于0.5 Kb）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1354）}
RiboLock RNase抑制剂（40U /μl）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：EO0381）}
生物素-14-CTP（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：19519-016）}
MEGAscript ^® T7转录试剂盒（*用于长于0.5 Kb的RNA）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1333）}
Novex ^® TBE-尿素凝胶，6％（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：EC6865BOX）}
1x TBE缓冲区
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14040-133）}
完全蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11697498001）
2x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737）
Dynabeads M-280链霉抗生物素蛋白（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11205D）}
2-巯基乙醇（β-巯基乙醇/BME）
10x Tris /甘氨酸/SDS运行缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610732）
4-20％Mini-PROTEAN ^® TGX无污染蛋白凝胶（Bio-Rad Laboratories，目录号：4568094）
溴化乙锭溶液（Sigma-Aldrich，目录号：E1510）
Spectra ^TM多色宽范围蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：26634）}
Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩物（Bradford试剂）（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
Tris-HCl（pH8.0）
KCl
MgCl 2
Nonidet P-40
EDTA
NaCl
Triton X-100
多聚赖氨酸提取缓冲液（PEB）（参见食谱）
2x Tris，EDTA，NaCl，Triton（TENT）缓冲液（参见食谱）
1x帐篷（见配方）

设备

PCR带管转子，微型离心机C1201（Denville Scientific，目录号：C1201-S [1000806]）
Veriti ^® 96孔热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4375786）}
紫外线透照仪
NanoDrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，目录号：ND-ONE-W）
Eppendorf Thermomixer ^® R（Eppendorf，目录号：022670581）
孵化器
Vortexer
电池刮刀
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5430R）
SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702525）或其他具有595 nm波长的分光光度计
MagneSphere（R）支架（Promega，目录号：Z5342）
Trans-Blot ^® Turbo ^TM转移起动器系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1704155）
Mini-PROTEAN ^{®四立式电泳池（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658004）}

程序

用于体外转录的引物设计和模板生成
1. 使用Primer 3在线工具（ http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）（Untergasser 等人，2012）（注1）
2. 如图1所示，加入实际正向引物序列上游的T7 RNA聚合酶启动子序列（T7）[5'AGTAATACGACTCACTATAGGG]（红线）（图1）。
3. 将引物溶解于无核酸酶的水中至终浓度为100μM，然后在无核酸酶的水（例如10天）中制备终浓度为1μM的正向引物和反向引物的引物混合物将每个引物从100μM储备液中加入980μl不含核酸酶的水中并充分混合）
4. 对于在0.2-ml PCR管中40μl的一次PCR反应，加入4μl10x DreamTaq DNA聚合酶缓冲液，10μl1μM引物混合物，1μlDreamTaq DNA聚合酶，1μl10mM dNTP混合物，0.2μl（〜2ng）cDNA和水，使最终体积为40μl。（如前所述[Panda等人，2016]，由总RNA制备cDNA。）
5. 通过涡旋混合反应5秒，并使用微型离心机离心PCR管条30秒，以沉淀孔底部的反应。
6. 设置Veriti ^® 96孔热循环程序如下：95℃5分钟，95℃5秒，60℃60秒60次循环。
7. 在溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上在100伏下解析PCR产物1小时，并用紫外线透射仪观察。
8. 从凝胶中切下所需的条带。使用QIAquick Gel Extraction Kit纯化与每个片段相对应的PCR产物，并溶解于试剂盒提供的洗脱缓冲液中。
9. 用NanoDrop分光光度计测量PCR产物/模板的浓度
10. PCR产物（T7 DNA模板）可以在-20°C或-80°C保存，或立即用于体外转录。
生物素化RNA片段的体外转录

生物素化的RNA可以按照制造商的方案使用MEGAshortscript ^TM T7试剂盒制备。

图1.生物素化RNA下拉测定示意图

每个DNA模板的体外转录反应可以在含有2μl10×MEGAshortscript ^{T7缓冲液，2μlMEGAshortscript TM的1.7ml PCR管中制备} T7酶混合物，1μlRiboLock，1μl75mM rATP，1μl75mM rUTP，1μl75mM rGTP，0.8μl75mM rCTP，1.5μl10mM生物素-14- CTP，100ng T7 DNA模板和水，使最终体积为20μl。（对于较长的RNA片段[500nt]，用户应该在体外使用MEGAscript TM T7试剂盒进行RNA制备）（注5和6）

混合并在500 x g下离心约5秒，以使管底部的反应混合物沉降。

在Thermomixer（注2）中，将反应在37℃下孵育4小时

加入试剂盒中提供的1μlDNA酶，并充分混匀，然后在37°C孵育15分钟

将样品储存在-20°C或-80°C或立即进行RNA纯化。
体外转录的生物素化RNA片段的纯化和质量检查
1. 将体外转录的RNA吸入柱顶部，并将柱放入新鲜的1.5 ml管中。
2. 以750×g离心柱离心2分钟以收集包含生物素化RNA的流通。
3. RNA浓度可以使用NanoDrop分光光度计测定
4. 将纯化的样品储存在-20°C或-80°C，直到检查RNA的质量
5. 为了检查RNA的质量，将1μg转录的RNA转移到新鲜管中，并在70℃下用MEGAshortscript试剂盒中提供的RNA样品制备缓冲液变性5分钟。
6. 用1×TBE缓冲液溶解在6％TBE-尿素凝胶上，并用溴化乙锭染色后在紫外线透射仪上显现RNA。
7. 所有RNA片段应显示预期大小的单一条带。
8. 将RNA样品储存在-20°C或-80°C或用于下拉反应。
细胞裂解物的制备
1. 用PBS洗涤两次10厘米浓度的约70％融合细胞，并用细胞刮刀收集。随着蛋白质产量随细胞系而变化，用户应调整每次下拉测定法提取至少500μg蛋白质所需的细胞数量。
2. 通过以500×g离心5分钟将细胞置于1.7ml管中。
3. 通过用500μl含有蛋白酶和RNA酶抑制剂的多聚糖提取缓冲液（PEB）移液10-20次来破坏细胞沉淀。在冰上孵育10分钟。
4. 使用冷冻离心机在4℃下以15,000×g离心10分钟收集上清液。
5. 根据制造商的说明书使用一次性比色皿和595 nm波长的分光光度计，通过Bradford蛋白测定法确定蛋白质浓度。
6. 将蛋白质样品储存于-20°C或-80°C或直接用于下拉反应。
相互作用的RNA结合蛋白的下调
1. 在含有500μg细胞裂解物，1μg纯化的生物素化RNA，1x蛋白酶抑制剂（加入新鲜），5μlRiboLock，250μl2xTent缓冲液（Tris，EDTA，NaCl，Triton）的1.5ml管中制备下拉反应;见食谱）和PEB，最终体积为500μl
2. 通过移液混合反应，并在室温下孵育30分钟
3. 同时，使用MagneSphere支架，用1x TENT缓冲液洗涤每次反应的50μl链霉亲和素偶联的dynabeads。
4. 向步骤E1（注7）中制备的RNA-蛋白混合物中加入50μl洗涤的珠。
5. 通过上下移动来混合珠子。
6. 将反应在室温下孵育另外30分钟，间歇混合，每隔5分钟点击管子。
7. 在磁架上孵育管1分钟，使磁珠沉入管的一侧
8. 弃去上清液，并用1ml冰冷的1x TENT缓冲液混合磁珠
9. 再次重复步骤E7和E8 3次。
10. 向磁珠中加入40μl含有β-巯基乙醇的1x Laemmli样品缓冲液
11. 在95℃加热样品5分钟，并进行Western印迹
检测相互作用的RNA结合蛋白（RBPs）
1. 使用Western印迹技术检测下拉中的RBP兴趣。简言之，在4-20％SDS-PAGE凝胶上载入至少三条泳道：（1）10μg（或用于下拉的蛋白质的2％）细胞裂解物作为输入，（2）来自下拉试验的全部样品，和（3）预染色蛋白梯。通过制造商的方案电泳解决这些样品。
2. 使用Trans-Blot转移系统按照制造商的说明书将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。
3. 使用标准的Western印迹技术使用识别RBP的一级抗体（Mahmood和Yang，2012）来检测感兴趣的RBP。
4. 与适当的二次抗体孵育以识别一抗，并使用增强化学发光（ECL）检测信号。

数据分析

如图1所示，蛋白质印迹分析揭示了输入裂解物（阳性对照）和使用生物素化片段C的下拉材料中RBP的存在，表明片段C中的序列包含与该RBP相互作用的区域。该分析包括阴性对照样品"仅珠子"和"控制生物RNA"，其不下拉RBP，并且显示片段A和B不结合RBP，支持RBP与片段C的结合是特异性的结论。应重复实验至少三次以得出RNA-RBP相互作用的特异性。

笔记

RNA片段的大小可以由研究人员决定，但建议在相邻片段之间重叠至少20bp。
体外转录反应的长时间（超过4小时）的孵育可能导致体外转录的RNA的降解。
作为对照，使用没有任何生物素化RNA的"仅珠子"样品，以查看在下拉条件下单独的磁珠是否与感兴趣的RBP结合。
使用不结合所研究的RBP的阴性对照（NC）生物素化RNA，例如GAPDH /ACTB ，以检查RBP与mRNA之间的相互作用的特异性兴趣。
该方案使用1个生物素-CTP：4个未标记的CTP（即，即5个CTP中的1/5是生物素标记的）的比率。调整生物素-CTP与未标记的CTP之间的比例，用户必须注意RNA产物中存在的Cs的数目。对于长转录物，生物素-CTP比可降低至1个生物素-CTP：10个未标记的CTP。
标记生物素化至非生物素化CTP比例高于1:4的RNA可抑制RBP结合。用户必须确保每个RNA片段在其序列中具有至少1或2个生物素化的Cs。
使用较高量的生物素标记的RNA不能帮助并且可能不利于下拉式测定，因为50μl链霉抗生物素蛋白磁珠可结合〜100 pmol生物素标记的RNA。
较长的RNA可能导致假阳性下拉结果，因为感兴趣的RBP可以通过另一个RBP间接与RNA诱饵相互作用。
PEB细胞裂解有效分离细胞质级分。因此，该方案最适用于研究细胞质蛋白与感兴趣的RNA的相互作用。由于与感兴趣的RNA或蛋白质的差异亚细胞定位，在细胞中与RNA诱饵相互作用的RBP可能或可能不与细胞相互作用。

食谱

不含核酸酶的水中的多聚糖提取缓冲液（PEB）
20mM Tris-HCl（pH7.5）
100 mM KCl
5mM MgCl 2
0.5％Nonidet P-40
2x Tris，EDTA，NaCl，Triton（TENT）缓冲液在无核酸酶的水中 20mM Tris-HCl（pH8.0）
2mM EDTA（pH8.0）
500 mM NaCl
1％（v/v）Triton X-100
1x TENT
等量的2xTENT和无核酸酶的水混合在一起

致谢

这项工作得到了国立卫生研究院老龄化研究方案的支持。

参考文献

Glisovic，T.，Bachorik，JL，Yong，J.and Dreyfuss，G。（2008）。 RNA结合蛋白和转录后基因调控。 FEBS Lett 582（14）：1977-1986。
Mahmood，T.and Yang，PC（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3456489/"target =" _blank">蛋白质印迹：技术，理论和麻烦。 N Am J Med Sci 4（9）：429-34。
熊猫，AC，Abdelmohsen，K.，Martindale，JL，Di Germanio，C.，Yang，X.，Grammatikakis，I.，Noh，JH，Zhang，Y.，Lehrmann，E.，Dudekula，DB，De，S 。，Becker，KG，White，EJ，Wilson，GM，de Cabo，R.and Gorospe，M。（2016）。 MYF5的新型RNA结合活性增强了肌发生期间的Ccnd1 /细胞周期蛋白D1 mRNA翻译。核酸抗体 44（5）：2393-2408。
熊猫，AC，Abdelmohsen，K.，Yoon，JH，Martindale，JL，Yang，X.，Curtis，J.，Mercken，EM，Chenette，DM，Zhang，Y.，Schneider，RJ，Becker，KG，de Cabo R.和Gorospe，M.（2014）。 RNA结合蛋白AUF1通过调节MEF2C表达水平来促进肌细胞生成。分子细胞生物学34（16）：3106-3119。
Popova，VV，Kurshakova，MM和Kopytova，DV（2015）。 [研究RNA-蛋白质相互作用的方法] Mol Biol（Mosk） 49（3）：472-481。
Untergasser，A.，Cutcutache，I.，Koressaar，T.，Ye，J.，Faircloth，BC，Remm，M.and Rozen，SG（2012）。< a class ="ke-insertfile"href = http://nar.oxfordjournals.org/content/40/15/e115.short"target ="_ blank"> Primer3-新的功能和界面。 核酸研究组40（15 ）：e115-e115。