材料和试剂

擦
1. 2 ml安全锁管（Eppendorf，目录号：022363352）
  注意：本产品已停产。
2. 乳胶无粉手套（Staples，Ambitex ^®，目录号：SS2072105）
3. 纱布（Fisaude。Kinefis，目录号：10901）
4. n。本草本植物在4-6叶充分膨胀的真叶中（见图1）
5. 快速冷冻的感染组织（来自DSMZ Plant Virus Collection的PVX病毒接种物，参考号：15649，DSMZ编号：PV-0847，莱布尼兹研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物收集物）
6. 液氮
7. 冰
8. 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：106346）
9. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（EMD Millipore，目录号：106559）
10. 磨料碳化硅粉（CARLO ERBA试剂，目录号：434786）
11. 磷酸钠缓冲液（见食谱）
农业滤清器
1. 培养皿（Gosselin，目录号：BP93B-102）
2. 50ml锥形离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
3. 13ml离心管（SARSTEDT，目录号：62.515.006）
4. 1毫升注射器，无针（BD，目录号：309659）
5. 10 ml无菌移液器（Corning，Falcon ^®，目录号：357551）
6. n。本地植物（在4-6叶阶段，见图1）
7. 携带具有PVX的全长cDNA克隆的T-DNA二元载体的农杆菌（根癌土壤杆菌）（任何解除武装的菌株，如GV3101）（Chapman等人，1992; Lu < em>等人，2003，见注释）
8. 携带空T-DNA二元载体的根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（任何撤防菌株，如GV3101）作为对照
9. 氯化镁（MgCl 2）（EMD Millipore，目录号：105833）
10. 2-吗啉代乙磺酸（MES）（SERVA服务科学家，目录号：29834）
11. 3'，5'-二甲氧基-4'-羟基乙酰苯胺（Acetosyringone）（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
12. 二甲基亚砜（DMSO）（EMD Millipore，目录号：102952）
13. Tryptone（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
14. 酵母提取物（Conda，目录号：1702）
15. 氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106404）
16. 美国细菌琼脂（Conda，目录号：1802）
17. 适当的选择性抗生素（卡那霉素和四环素）（Sigma-Aldrich，目录号：K1377,87128）
18. 诱导缓冲液（参见食谱）
19. 补充适量抗生素的LB液体培养基（见食谱）
20. 补充有适当抗生素的LB /琼脂培养基（参见食谱）
蛋白质印迹检测
1. 1.5 ml安全锁管（Eppendorf，目录号：0030120086）
2. Polyvinil PVDF膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
3. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）碱（EMD Millipore，目录号：108386）
4. 盐酸（HCl）（盐酸37％）（EMD Millipore，目录号：100317）
5. 乙二胺四乙酸（EDTA）（EMD Millipore，目录号：324503）
6. 氯化锂（LiCl）（EMD Millipore，目录号：105679）
7. β-巯基乙醇溶液（EMD Millipore，目录号：805740）
8. 十二烷基硫酸钠（SDS）（EMD Millipore，目录号：817034）
9. 溴苯酚蓝（BPB）（Sigma-Aldrich，目录号：114391）
10. 甘油（甘油87％溶液）（EMD Millipore，目录号：104094）
11. 3-羟基-4-（2-磺基-4- [4-磺基苯偶氮基]苯偶氮）-2,7-萘二磺酸钠盐（Ponceau S）（Sigma-Aldrich，目录号：P3504）
12. 乙酸（醋酸冰100％溶液）（EMD Millipore，目录号：100063）
13. 氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：116224）
14. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：60230）
15. 氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：104936）
16. 丙烯酰胺（30％丙烯酰胺/双溶液，37.5:1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610158）
17. 兔抗PVX CP抗体（LOEWE Biochemica，目录号：07037）
18. 与AP缀合的山羊抗兔抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A3687）
19. SigmaFast ^{TM BCI/NBT片剂（Sigma-Aldrich，目录号：B5655）}
20. 用于Western印迹的蛋白质提取缓冲液（参见食谱）
21. 2x Laemmli溶液用于Western印迹（参见食谱）
22. Ponceau S解决方案（见配方）
23. 阻塞解决方案（见配方）
24. 10倍PBS，pH 7.4（参见食谱）

设备

普通设备
1. 植物生长室（三洋电子）在24°C，2500 lux的日光强度，16 h/8 h日/夜光周期
2. P1000，P200和P20微量移液器（Gilson，Pipetman Classic ^TM）
摩擦
1. 砂浆和杵（Silico& Chemico瓷器SE）
2. 冷藏台式微量离心机（Hettich Lab Technology，型号：Mikro 200R）
3. Pacisa称重天平（Precisa Gravimetrics，型号：XB620C-G）
农业滤清器
1. 28℃用于培养皿的培养箱（JP Selecta，型号：2001258）
2. 28°C冷藏培养箱振动筛（Eppendorf，New Brunswick Scientific，型号：4330）
3. 冷冻离心机13 ml管（Hettich Lab Technology，型号：Universal 320R）
4. 600nm波长敏感分光光度计（Eppendorf，型号：Bio Photometer 6131 000.012）
蛋白质印迹检测
1. 蓝色聚丙烯，1.5粒Eppendorf管的颗粒杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359947）
2. Thermomixer（Eppendorf，目录号：5384000012）
3. 软木塞（Sigma-Aldrich，目录号：Z165220）

程序

擦
1. 必须从受感染的叶子获得组织提取物。可以使用商业病毒接种物作为起点（来自DMSZ的PVX，参见材料和试剂）。以相同的方式，可以使用来自植物的PVX感染组织，这些组织先前已通过机械手段接种。在感染后7天从这些植物获得的组织可以有效启动病毒繁殖。植物组织应来自植物的上部叶，通常表现出最明显的症状。尝试选择叶片的近端部分，因为病毒感染前沿并不总是到达远端部分。丢弃最大的叶脉（见图1）
  
  图1.感染后7天时PVX感染的叶子显示症状。用作具有明显感染症状的源材料叶（左侧）。尝试选择叶片的近端部分并丢弃最大的叶脉（右侧，白色选定的区域）。
2. 收集300-400 mg等份的组织。取一等份并保存在液氮中，将其余部分储存在-80°C。丢弃已经解冻的组织。
3. 用用液氮冷冻的研钵和研杵研磨感染组织。尝试获得细粉。
4. 将冰醋酸缓冲液（参见食谱）的体积为5当量加入到粉末中，同时将冰浆上的砂浆（即，将300mg粉末状组织与1.5ml缓冲液混合）保持在一起。组分通常会冻结，因此将其与杵混合，直到获得均匀的液体混合物
5. 取出提取物混合物用微量移液管，并将其放入2 ml管中。使用切割技巧。将混合物保持在冰上以防止降解。
6. 在4℃和16,000×g离心5分钟。
7. 取上清液弃去沉淀。将上清液放入新的2 ml管中。保存在冰上（供立即使用）或储存于-80°C（长期使用）。
8. 选择在长日照条件下种植的合适植物。这些植物必须处于4-6完全扩张的真叶的阶段（见图2），以使植物完全易受病毒感染。具有碳化硅粉末的粉尘使两个完全膨胀的叶子的整个正面表面（参见注释）每个植物。金刚砂的量应足以在叶子上观察。按照与所有选定植物相同的步骤。
  
  图2.本田烟草植物 这些植物必须处于4-6叶充分展开的阶段，以使植物完全易受病毒感染。白色箭头指出可能摩擦的叶子。
9. 将病毒提取物放在整个植物池的每个金刚砂喷洒叶上（见图3）。直接用移液管放在近轴表面。每个叶子使用20μl提取物，每半叶加10μl。立即进行下一步骤，以避免提取物蒸发。
  
  图3.病毒提取物的递送。每个选择的叶子使用20μl提取物，每半叶加入10μl（左侧）。一滴病毒提取物用白色箭头标记（右侧）。
10. 必须使用乳胶手套仔细擦拭每个选定的叶子（见图4）。叶可以用一只手持续，另一只则用于摩擦。尽量不要按下它，只需轻轻地在表面上轻轻地移动手指三次。在开始下一步之前，请确保病毒提取物完全覆盖叶子（见图5）
  
  图4.摩擦。必须使用乳胶手套仔细擦拭每个选定的叶子。
  
  图5.叶片必须被病毒提取物完全覆盖。正确的方法（左侧）是通过仔细摩擦来进行的;错误的方法（右侧，白色箭头）在一段时间后在叶面上产生伤害。
11. 作为对照组，按照与上述相同的步骤，用健康植物制成的组织提取物接种相同数量的植物。这些植物通常被称为"模拟接种"。继续之前更换手套。植物数量取决于实验设计。虽然这个协议非常成功，但值得考虑的是十个工厂作为最小代表性的样本量
农业滤清器
1. LB /琼脂上的板用适当的选择性抗生素培养相应的农杆菌构建体。尝试在开始实验前3天对细菌进行平板：该程序确保在液体培养基中获得具有适当年龄和较高生长速率的菌落（见下一步骤）。
2. 拿起一个殖民地，长到一直饱和。使用6 ml补充有适当抗生素的LB培养基，在50ml Falcon管中，并以230 rpm（每分钟转数）和28°C固定一个孵化器振荡器。
3. 使用13ml管以1,660×g离心一定体积的饱和培养物10分钟。丢弃上清液。此步骤不需要光密度测量。
4. 使用诱导缓冲液重悬土壤杆菌沉淀（参见食谱）。通过移液轻轻混合，直到获得均匀的溶液。建议使用三个体积的诱导缓冲液（即，从6ml过夜培养物获得的每粒沉淀18-20ml的诱导缓冲液）。
5. 测量600nm波长（OD 600）的光密度。它应该在大约600 〜1
  之间
6. 必须尝试不同的稀释度才能达到正确的目的。使稀释液加入更多的诱导缓冲液。 OD 600至0.2足以感染N。本ham iana
7. 在室温下，在黑暗的地方孵育农杆菌溶液3小时。
8. 使用1毫升无针注射器通过叶子的背面渗透溶液，同时用食指从另一侧推（见图6）。每个植物渗透两个完全扩张的叶子，每半叶叶数为0.5ml（见图7）。这个程序使病毒感染从植物下部容易传播到新出现的组织上。这些植物必须处于4-6个完全扩张的真叶的阶段（见图2），它们应该在长的日子条件下生长。
  
  图6. Agroinfiltration。使用1毫升无针注射器渗透溶液。
  
  图7.每株植物渗透两片完全膨胀的叶子。每半叶使用0.5毫升。渗透区域以白色圆圈显示。
9. 按照相同的步骤渗透对照组。植物数量取决于实验设计。虽然这个协议非常成功，但值得考虑的是十个工厂作为最小代表性的样本量

数据分析

感染PVX的年轻植物可以通过肉眼从感染后6天容易地与未感染的植物区分开，但是当植物在较旧的阶段感染时可能更困难。此外，在不同的实验条件下检查病毒积累将是有趣的。因此，使用抗PVX外壳蛋白（CP）的抗体可能通过Western印迹监测PVX。简单地说

取100毫克感染的全身组织，并放入1.5毫升的液氮管中。使用15毫米直径的软木钻头收集四片盘更容易。按照与健康对照相同的步骤。
加入400μl蛋白质提取缓冲液（参见食谱），并使用蓝色，聚丙烯，颗粒杵匀浆
取50μl均质溶液，并与50μl2x Laemmli溶液充分混合（参见食谱）。使用Thermomixer在95℃下煮沸样品3-5分钟，并以最大速度离心5分钟。
使用16μl上清液进行SDS-PAGE电泳;任何用于SDS-PAGE的方案都可以成功应用（Aguilar等人，2015）。由于PVX CP蛋白质的分子量约为25 kDa，因此在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中解析蛋白质。将蛋白质从凝胶转移到Hybond-P PVDF膜，并用Ponceau S溶液染色印迹膜（参见食谱）以检测Rubisco蛋白作为加载对照。通过将膜与溶液孵育并轻轻摇动5分钟可以容易地实现Ponceau S染色。在进行下一步骤之前，用水清洗并轻轻晃动5分钟去除膜
在室温下用封闭溶液孵育膜2小时（参见食谱），然后在室温下，用稀释在1/400封闭溶液中的兔抗PVX CP抗体孵育过夜。第二天，在封闭溶液中用1/10,000稀释的第二抗兔AP缀合抗体孵育1小时。最后，使用基于碱性磷酸酶介导的生成反应的BCIP/NBT片剂系统开发

图8.在过滤后7天，PVX感染的植物的Western印迹。该图显示属于相同Western印迹的三条不连续的线，M：分子量标记（kDa），H ：健康植物提取物和PVX：PVX感染植物提取物。上图显示了抗PVX CP抗体孵育和BCIP/NBT显色反应的结果。下图显示了在抗体孵育之前印迹的Ponceau S染色膜，用于Rubisco蛋白检测作为载体对照。

笔记

pGR107（Chapman等人，1992; Lu等人，2003）是一种常用的二元载体，源自DC Baulcombe教授组，其携带感染性PVX cDNA克隆，其中包含一个额外的CP启动子和一个多接头，使得插入外来序列成为可能
病毒症状在接种后4天开始显着（dai），达到6-8 d之间。症状在第一次出现之后的一周开始消失，这种现象被称为"恢复"
应用摩擦方法，用金刚砂填充50ml管，并覆盖2-3层纱布。这种"自制"系统允许其适当的交付。
要应用摩擦方法，重要的是使用相同种类的手套，并遵循相同的摩擦模式，以达到重现性。

食谱

磷酸钠缓冲液
20mM NaH 2 PO 4/Na 2 HPO 4，pH 7.0
诱导缓冲液（100ml）
1ml MgCl 2储备溶液（最终：10mM MgCl 2）
1 ml MES储备溶液（最终：10 mM MES）
150μl乙酰丁香酮储备溶液（最终：150μM乙酰丁香酮）
用灭菌的双蒸水完成最终体积为100 ml 库存解决方案：
1M MgCl 2（氯化镁）
1 M MES（2-吗啉代乙磺酸）缓冲液，pH 5.7
溶于DMSO（二甲基亚砜）的100mM乙酰丁香酮（3'，5'-二甲氧基-4'-羟基乙酰苯酮）
Luria肉汤培养基（LB培养基），pH 7.0
1％（w/v）胰蛋白胨
0.5％（w/v）酵母提取物 1.0％（w/v）NaCl
LB /琼脂培养基 LB + 1.5％（w/v）琼脂
用于Western blot的蛋白质提取缓冲液 0.1M Tris-HCl，pH8.0
10 mM EDTA
0.1 M LiCl
1％（v/v）β-巯基乙醇
1％（w/v）SDS
库存解决方案：
1M Tris-HCl（三羟甲基 - 氨基甲烷和盐酸），pH8.0
0.5M EDTA（乙二胺四乙酸），pH8.0
20％SDS（十二烷基硫酸钠）溶液
2x Laemmli溶液用于Western blot检测 4％（w/v）SDS
2％（v/v）β-巯基乙醇
0.1M Tris-HCl，pH6.8。
0.05％（w/v）BPB粉末试剂
20％（v/v）甘油库存解决方案：
1M Tris-HCl（三羟甲基 - 氨基甲烷和盐酸），pH6.8
Ponceau S解决方案
0.1％w/v Ponceau S粉末试剂 5％v/v乙酸溶液
阻塞解决方案
5％w/v脱脂奶粉
10 mM 1x PBS缓冲液库存解决方案：
10倍PBS（磷酸缓冲盐水），pH 7.4
10×PBS，pH 7.4（1L）
80克NaCl（氯化钠）
2.0克KCl（氯化钾）
14.4g Na 2 HPO 4（磷酸二氢钠）
2.4g KH 2 PO 4（磷酸二氢钾）
用无菌双蒸水完成1L的最终体积

致谢

通过修改用于pGR106的程序（Lu et al。，2003），为T-DNA二元载体pGR107开发和优化了该方案。大肠杆菌是前西班牙教育和体育部的FPU奖学金的接受者。这项工作得到了西班牙经济与竞争力部（Grant Ref。BIO2013-47940-R）的支持。大韩民国农村发展管理局（RDA）（Grant Ref。PJ00946102; PJ010246）。

参考文献

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