材料和试剂

实验室胶带（VWR，目录号：89097）
剃须刀剃须刀（VWR，目录号：55411-060）
Kimwipes（ULINE）
转移移液器（Globe Scientific，目录号：137038）
将皮肤粘合到玻璃上的基于氰基丙烯酸酯的粘合剂（即，乐泰玻璃胶; Amazon.com; Scognamiglio等人，2016）
在表达Pax7的肌肉干细胞（或感兴趣的细胞类型）中具有GFP或YFP表达的小鼠; GFP和YFP Cre报告小鼠和Pax7-Cre-ERT2小鼠品系可以在Jackson Laboratory（THE JACKSON LABORATORY，目录号：021847,006148和012476）分别获得
异氟烷（Patterson Veterinary Supply，IsoFlo ^{®，目录号：07-806-3204;直接应用于设备清单4的蒸气室;由图2中的箭头表示）}
EtOH，70％（Decon Labs，目录号：V1401）
蒸馏水（室内）

设备

装有Leica 25x/0.95水体物镜的反向Leica SP5（或等效物），附着在舞台上的35mm培养皿保持架以及在495nm处分离可检测光谱（430-550nm）的二向色镜的非扫描检测器（图1）

图1.反向多光子设置成像设置包括一个倒置的共聚焦显微镜，配有25x水样，配有培养皿支架，多光子激光和计算机。
Chamelion Vision激光（相干）
具有足够面积的加热垫覆盖显微镜平台上的动物（Sunbeam 756-500来自Amazon.com的加热垫）
装有感应室的动物麻醉系统以及鼻锥管（VetEquip，目录号：901806）。使用前请咨询操作说明书
35 mm fluorodish（世界精密仪器，目录号：FD35-100）
金属铲（VWR，目录号：82027-530）
防护手套（VWR）
本生灯（VWR，目录号：89038-528）
层流通风柜
精细镊子（Dumont＃5镊子）（精细科学工具，目录号：11252-30）
用于切割皮肤的精细剪刀（直，11.5厘米）（精细科学工具，目录号：14058-11）
用于切割筋膜的弹簧剪刀（8毫米刀片）（精细科学工具，目录号：15009-08）

软件

徕卡SP5软件
斐济（斐济是ImageJ的更新版本，开源图像处理软件; Schindelin等人，2012）
Imaris（Bitplane，版本7.6.4，适用于Windows X64）

程序

道德声明：本文讨论的所有程序均符合卡内基科学机构动物保护和使用委员会的批准。

活检成像设置

打开反相共聚焦显微镜和多光子（MP）激光。将GFP设置为920 nm进行GFP检测，或将940 nm用于EYFP检测。
启动Leica成像软件。
打开加热垫并加热至35°C。
开始氧气流到麻醉机，然后开始用1.7％异氟烷填充诱导室（通过将容器顶部的转盘调整到1.7），将流量计指示器球调整到1（1L/min流速）（见图2）
将鼠标置于诱导室中以开始麻醉（图2），并继续进行修饰的氟化物。麻醉的小鼠可以停留在感应室中持续这段时间（约20分钟）。如果氟牙膏制剂需要更长时间，则可以将鼠标留在感应室中，而不用担心，因为它们将在成像期间继续放置在类似的麻醉条件下。

图2.麻醉设置这包括具有调节器，感应室和鼻锥的麻醉机（如图4所示）。

准备修改的氟染色以安装在鼠标的腿上
1. 穿着防护手套，在通风橱里的本生灯上加热金属铲。
2. 使用加热刮刀熔化并去除2-3厘米的氟壁。注意不要使氟染色体的底部熔化和变形，当将荧光剂装入显微镜台架时（参见步骤4e），这可能是有问题的。重要的是留下一部分氟牙膏以固定和稳定在舞台上。
3. 重复步骤2a和2b，并从氟染色的相对侧移除第二部分。
4. 这可以提前完成;可以制备和储存多种荧光素以备将来使用（图3）
  
  图3.修改的氟化物
在小鼠上安装荧光

将鼠标从诱导室移动到手术表面，其中带有附着鼻锥的麻醉管已用胶带固定（图4）。
通过观察鼠标检查麻醉水平。鼠标应保持稳定的呼吸速率，但不会对腿部皮肤上的镊子产生轻微的夹持作用。如果老鼠的呼吸非常缓慢，将异氟烷降至1.3％至1.5％。如果当腿部被挤压时鼠标退缩，则等待更长时间才能进入更深的麻醉状态，然后继续。
使用剃须刀刮去头皮以覆盖胫前肌（TA）肌肉。开始在脚踝处剃须，然后上膝盖。从小腿去除任何失去的头发。这可以通过用70％EtOH洗涤皮肤，然后用Kimwipes洗涤去除松散的毛发。
准备粘合剂并放在一边。
用镊子将一小块皮肤从剪刀上切开，然后从脚踝附近开始向膝盖切开，从TA上方的区域切出一条薄薄的皮肤。不要去除太多的皮肤，只能在TA上露出1-2厘米的²区域。
通过轻轻拉起TA侧面的膜，然后用剪刀切割，去除覆盖TA的筋膜。人们可以通过使用镊子在TA的边缘拉动膜而不与要成像的组织直接接触来避免损伤肌肉。
将修改后的氟化物放置在鼠标的腿部上，使得表面与暴露的肌肉齐平，鼠标的上腿/身体和小腿/脚踝适合已移除的碗壁上的空间。通过握住鼠标的腿与盘的玻璃底部接触来将盘固定在适当位置。修饰的荧光的剩余侧面应与待成像的小鼠肢体的长度平行。
在将盘保持在适当位置时，涂抹粘合剂，使皮肤与玻璃接触。在整个周边涂抹粘合剂，并将粘合剂固定在90秒以上，同时将盘固定在适当位置。

图4.安装在鼠标上的氟化物伪彩色白色环表示使用鼻锥麻醉进行粘合剂的位置。
开始以1升/分钟用1.7％异氟烷填充感应室。保持流向鼻锥。
粘合剂固定后，将鼠标移至感应室，停止流向鼻锥。

定位鼠标进行活体成像

将具有鼻锥的麻醉管贴到显微镜载物台上
如果使用水浸物镜，将水施加到物镜表面。
将1.7％异氟烷以1升/分钟的速度交付给鼻锥出口。
从感应室取出鼠标，放在显微镜平台上，将鼠标头放入鼻锥。用胶带把头固定在鼻锥上。鼠标应位于其腹部。当放置在背部时，肺常常会过早终止成像（〜1-2小时）。
将氟化物置于固定在舞台上的培养皿中（图5I）
使用Leica SP5的落射荧光功能将物镜提升到位置并识别成像场。一条胶带可以放置在鼠标的身体的下部（连接到舞台的两侧），以减少呼吸的运动。
将加热垫放在鼠标上（图5II）
以1升/分钟将麻醉减至1.3％异氟烷。

图5.用于活体成像的鼠标。 I.舞台设置。 A）暴露的TA肌肉用于成像安装到修饰的荧光。 B）鼻锥麻醉器附着于舞台。 C）培养皿架。 D）具有H 2 O 5的25倍水体（如下图所示）。二，显微镜设置与定位加热垫。

图像捕捉参数和分析

以3μm的步长捕获串联光学部分，总共深度为150-200μm，每3分钟长达8 h。在400Hz下扫描场为0.31至0.62mm ^{2。成像后，处死小鼠。由于使用的粘合剂，不可能除去氟染，而不会对适当的缝合造成额外的组织损伤，并且氟化物太笨重，不会留在小鼠上而不影响移动性。}
图像序列文件（.lif）可以在斐济打开并转换成.tiff堆栈或图像序列进行分析。

数据分析

数据存储，传输和处理：

徕卡生成的.lif文件的范围可以是3到8 GB。
单个.tiff图像序列（使用斐济从.lif转换）约为3 GB（3D时间流逝）。
单个.tiff堆栈（3D时间流逝）≤1 GB。
单个.tiff堆栈（2D时间流逝）≤100MB。
.avi电影不超过20 MB。
图像序列可以使用Fiji插件对齐，ImageJ 2.0.0'正确的3D漂移'。
可以使用斐济（例如，细胞的长轴和分割角测量以及细胞迁移方向的测量）进一步分析漂移校正的图像序列。 Imaris 7.6.4用于4D渲染，单元格跟踪，迁移统计和4D电影。
已处理的数据（图像和视频）和统计分析发布在Webster等人。（2016），可以在以下网址找到： http://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909（15）00503-2

笔记

光透射的障碍包括头发，红细胞，epimysium和粘合剂。这可以通过在步骤3d中从脚上脱掉所有失去的毛发来避免，在步骤3e和3f中最小化皮肤移除和损伤脉管系统，在步骤3f中去除覆盖暴露的TA的所有膜，并确保粘合剂不覆盖暴露的组织在步骤3i。
将氟染色固定在腿上可能是相当具有挑战性的，可能需要一些练习。在粘合剂管上安装P1000吸头可以使粘接剂更容易地接触到外露TA的周边的皮肤和玻璃界面。
放置在舞台/显微镜上的护罩可能需要阻挡环境光引起高背景信号，特别是在使用非常敏感的非下行探测器时（图6）。
对于长时间成像会话，需要重复使用水。为了克服暂停实验和向物镜施加水的麻烦，可以使用输水物镜环盖和泵装置（New Era Pump Systems，Inc.）。
通过相应地调整MP波长和检测滤波器，可以将该协议适用于其他荧光蛋白（即，例如，tdT，CFP）。
本方案中使用的所有试剂均为直接购买和直接使用，无任何稀释或混合。

图6.使用护罩成像

致谢

这里报告的方案得到NIH的NIAMS的支持，获奖号为F32AR065366（MTW）和RO1AR060042（至C-MF）以及卡内基学会（至TH）的校内基金。该协议是衍生自Cell Stem Cell之前的出版物的修改版本（在引用中引用，Webster等人，2016）。

参考文献

Rompolas，P.，Deschene，ER，Zito，G.，Gonzalez，DG，Saotome，I.，Haberman，AM and Greco，V。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22763436"target ="_ blank">干细胞的活体成像和生理性毛囊再生中的后代行为自然 487：496-499。
Schindelin，J.，Arganda-Carreras，I.，Frize，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B 。，Tinevez，JY，White，DJ，Hartenstein，V.，Eliceiri，K.，Tomancak，P。和Cardona，A.（2012）。斐济：用于生物图像分析的开源平台。 Nat方法 9（7 ）：676-682。
Scognamiglio，F.，Travan，A.，Rustighi，I.，Tarchi，P.，Palmisano，S.，Marsich，E.，Borgogna，M.，Donati，I.，de Manzini，N。和Paoletti，（2016）。普通外科应用的粘合剂和密封剂界面。 J Biomed Mater Res B Appl Biomater 104（3）：626-639。
Webster，MT，Manor，U.，Lippincott-Schwartz，J.and Fan，CM（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26686466"target ="_ blank">活体成像显示鬼纤维作为在再生期间引导肌原性祖细胞的构建单位。细胞干细胞 18（2）：243-252。