p class ="pptt"> 材料和试剂

15 ml锥形离心管（Corning，Falcon ^®）
聚丙烯微量离心管1.5 ml（Eppendorf）
0.3ml聚丙烯色谱瓶（Focus Technology，型号：VP91），聚丙烯盖和PTFE /硅隔片（Focus Technology，型号：SC9291）
4mm亲水性PTFE注射器过滤器，孔径0.22μm（南通滤膜，目录号：FBS4PTFE022L）
47mm孔径为0.45μm的亲水PTFE膜（南通滤膜，目录号：FBM047PTFE045L）
玻璃珠212-300μm（Sigma-Aldrich，目录号：G9143-250G）
1ml一次性聚丙烯注射器（B.Braun Medical，目录号：9166017V）
Millex-GS 33毫米孔径为0.22微米的无菌注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGS033SS）
Milli-Q水
液氮
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）（Carl Roth，目录号：HN95.2）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：3904.1）
正磷酸（H 3 O 3 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：W290017）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS-100G）
氯化钠（NaCl）（Duchefa Biochemie，目录号：S0520.1000）
氯化钾（KCl）（Duchefa Biochemie，目录号：P0515.1000）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：P030.2）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2393-100g）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Duchefa Biochemie，目录号：C0504.1000）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148-2.5L-D）
L-Asc钠（Sigma-Aldrich，目录号：4034-100G）
乙腈HPLC梯度等级（VWR，HiPerSolv Chromanorm ，目录号：83639.320）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
提取缓冲液（见配方）
HPLC流动相A（参见食谱）
HPLC流动相B（参见食谱）
钠L-Asc标准溶液（见配方）

设备

权杖^{TM手持式自动细胞计数器（EMD Millipore，目录号：PHCC00000）}
Scepter ^TM传感器 - 40μm（EMD Millipore，目录号：PHCC40050）
冷藏台式离心机和微量离心机
HPLC系统（Shimadzu Scientific Instruments）装备有：

LC泵（Shimadzu Scientific Instruments，型号：LC-20AD）
恒温自动进样器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：SIL-20AC）
光电二极管阵列检测器（Shimadzu Scientific Instruments，型号：SPD-M30A）
柱式炉（Shimadzu Scientific Instruments，型号：CTO-20AC）
直接安装有保护柱AQ C18 4.0×3.0mm（Phenomenex，目录号：KJ0-4282）的Synergy hydro 4u Hydro-RP 80Å250×4.6mm（Phenomenex，目录号：00G-4375-E0）

软件

LabSolution（Shimadzu Scientific Instruments）

程序

样品制备
1. 准备液体衣原体培养物，并在培养物处于指数生长阶段时收集1ml样品。将样品与19ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）混合。使用权杖细胞计数器按照屏幕上显示的说明来确定细胞数量和细胞体积。简单地说，压下柱塞，淹没尖端，释放柱塞，将50μl的液体培养液吸入顶端。权杖细胞计数器检测通过尖端的孔的每个细胞，计算细胞密度，并在屏幕上显示细胞直径或体积的直方图（Johnston，2010）。
2. 基于计算的细胞密度，收获2×10 6细胞，将其置于15ml圆锥形离心管中，并在室温下以12,000xg离心1分钟。
3. 轻轻地将沉淀的细胞重新悬浮在1毫升Milli-Q水中，重复离心步骤
4. 弃去上清液，并在液氮中冷冻沉淀。样品可以在-80°C下储存数月。
5. 向冷冻的沉淀中加入200μl提取缓冲液，并通过剧烈摇动进行混合。提取缓冲液含有TCEP，以减少形式的Asc
6. 将再悬浮的细胞转移到含有100μl玻璃珠的1.5ml微量离心管中，并以最大速度涡旋30秒。在室温下孵育样品2分钟（样品变成棕色），然后放在冰上。
7. 在4℃下将样品以4,000 x g离心30分钟
8. 收集120μl上清液（不搅拌沉淀），并使用孔径为0.22μm的4 mm亲水性PTFE注射器过滤器将其过滤到色谱瓶中。样品在4℃下稳定24小时，可以在-80℃下储存几个月;但是，应避免冻融周期。
通过HPLC测定Asc浓度（参见Nováková等人，2008a理论基础）
1. 使用Synergy hydro 4u Hydro-RP 80Å250 x 4.6 mm色谱柱可以有效地色谱分离抗坏血酸。将配有合适的保护柱（AQ C18 4.0 x 3.0 mm）的色谱柱连接到HPLC。用流动相A平衡柱至少30分钟，流速为1 ml/min。
2. 将自动进样器的纸盘温度设置为4°C，柱温箱温度设置在20°C。
3. 在等待温度和基线稳定的同时，准备样品序列表。将含有样品的色谱柱插入自动进样器的纸盘。
4. 注入20μl样品。对于Asc的洗脱，使用50mM KH 2 PO 4的等度流动相（pH2.5，用正磷酸调节）5分钟，流速1 ml/min，然后在3.5至6分钟之间施用0％至30％的短乙腈（流动相B）梯度洗脱柱中较不极性的组分。 8至9分钟后，流动相B的百分比降低至0％，并将柱平衡至流动相A另外9分钟。总运行时间为18分钟。
5. 以4 Hz的采样频率和1,024光谱分辨率将信号记录在190和500 nm之间，狭缝设置为8 nm。 Asc峰出现在约5.1分钟，吸收最大值在244nm附近。

数据分析

准备在0.2和50μMAsc溶解在提取缓冲液中的两倍连续稀释。通过LabSolution软件（Shimadzu Scientific Instruments）在HPLC色谱图中确定Asc的峰面积，并使用线性拟合获得校准曲线（图1）。

图1.在244nm处记录的典型HPLC色谱图和用于测定L-Asc浓度的校准曲线A.（a）62.5μML-Asc溶解在提取缓冲液（95％正磷酸，2mM EDTA，10mM TCEP，pH 2.5）和（b）C。细胞提取物。鉴定的峰是（1）正磷酸; （2）EDTA; （3）L-Asc。 B.基于峰面积的线性拟合计算的L-Asc浓度的校准曲线，并使用1 /面积加权。 LOD和LOQ值分别为0.2和1.5μM
使用以下公式计算细胞Asc浓度：

笔记

C的平均单元格容积。 reinhardtii 约为200 fl。 CC124C的典型Asc浓度。在大约80μmol的光子中，在液体Tris-乙酸盐 - 磷酸盐介质中生长三天的细胞膜细胞约为40μM。然而，细胞Asc含量强烈地取决于藻类菌株，生长培养基，培养物的年龄，生长光和胁迫条件（Nagy等人，2016; Vidal-Meireles 等，未发布）。
提取缓冲液含有TCEP，保持Asc更稳定的还原形式;因此，通过上述方法，测定总细胞Asc浓度（脱氢抗坏血酸+ Asc）。然而，如果需要确定细胞内脱氢抗坏血酸的量，则从提取缓冲液中省略TCEP。在这种情况下，样品应在不到2小时内进行处理和测量，不能冻结。脱氢抗坏血酸盐在244nm处不吸收，因此基于在存在或不存在TCEP的244nm处的吸收差异来计算Asc与脱氢抗坏血酸的比例。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS，1升;基于Chazotte，2012）
8克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24g KH 2 PO 4
0.1g MgCl 2·6H 2 O
Milli-Q水
溶解在Milli-Q水中的盐，并用HCl将pH调节至7.2 通过加入Milli-Q水将体积达到990ml，并将溶液分配至等分试样通过在121℃高压灭菌20分钟，液体循环15psi来消毒溶液
将0.133g CaCl 2·2H 2 O在10ml Milli-Q水中溶解，对其进行过滤灭菌并在高压灭菌后将其加入溶液中
在室温下储存无菌PBS
提取缓冲液（100ml;基于Nováková等人，，2008b）
74.448mg EDTA
286.65 mg TCEP
Milli-Q水
将盐完全溶解于Milli-Q水中加入5ml的98％正磷酸将溶液分配到等分试样中，并储存在-80°C直到使用
HPLC流动相A（1L）
6.8045g KH 2 PO 4
Milli-Q水
用98％正磷酸将pH调节至2.5 使用0.45μm亲水PTFE膜过滤溶液
注意：此解决方案必须新鲜准备。
HPLC流动相B（1L）
100％乙腈
脱气通过室温超声处理20分钟
钠L-Asc标准溶液
将49.5mg L-Asc溶于1ml提取缓冲液中，得到50mM L-Asc溶液，稀释10μl等分试样在10ml提取缓冲液中准备从该50μM储备溶液的两倍稀释系列至0.2μM
注意：此解决方案必须新鲜准备。

致谢

这项工作得到了匈牙利科学院（LP-2014/19）和国家研究开发办公室（研究资助NN114524）的Lendület/Momentum计划的支持。

参考文献

Chazotte，B。（2012）。用荧光标记高尔基体神经酰胺。冷泉哈勃原菌 2012（8）。
Johnston，G.（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2010/April/Automated-handheld-instrument-improves-counting-precision-跨多重细胞系/生物技术-239463.html"target ="_ blank">自动手持式仪器可提高多个细胞系的计数精度。 BioTechniques 48：325-327
Nagy，V.，Vidal-Meireles，A.，Tengölics，R.，Rákhely，G.，Garab，G.，Kovács，L.andTóth，SZ（2016）。< a class ="ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26714836"target ="_ blank">硫剥夺期间的抗坏血酸积累及其对光系统II活性和H 2生产的影响绿藻藻衣原体植物细胞环境39（7）：1460-1472。
Nováková，L.，Solich，P.和Solichová，D.（2008a）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993608001805"目标="_ blank">同时测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的HPLC方法。趋势分析化学 27：942-958。
Nováková，L.，Solichová，D.，Pavlovičová，S.和Solich，P。（2008b）。用于测定抗坏血酸的亲水相互作用液相色谱法。< J Sep Sci< 31（9）：1634-1644。