材料和试剂

来自ATCC的MCF-7或Caco-2细胞
注意：该方案可以容易地扩展到任何其他内皮细胞或上皮细胞系，具有明确定义的细胞 - 细胞连接，如AML12细胞。
质粒（或慢病毒）表达连接标记物，如E-钙粘蛋白-GFP。
Priya和Gomez（2013）参阅Bio-protocol e937，用于在内源性人E-钙粘蛋白敲低细胞中表达小鼠E-钙粘蛋白-GFP的慢病毒制剂。在该方案中，我们描述了用于过表达E-钙粘蛋白-GFP的细胞的转染
编码E-cadherin-GFP（Addgene，目录号：67937）或任何其它连接蛋白如ZO-1（Addgene，目录号：30313），纽蛋白（Addgene，目录号：30312），MRLC（Addgene，catalog编号：35680）或肌动蛋白标记Utrophin（Addgene，目录号：26737）
Lipofectamine 3000和P3000试剂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：L3000015）}
Dulbecco改良的Eagle中等高葡萄糖与稳定的L-谷氨酰胺（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11995-073）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26140079）}
不含Ca 2+的PBS和Mg 2+（Astral Scientific，目录号：09-8912-100）
Opti-MEM介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985070）
汉克平衡盐溶液（HBSS）（Sigma-Aldrich，目录号：H8264）
CaCl 2
成像媒体（见配方）

设备

激光扫描共焦显微镜，LSM 510 Meta Zeiss共焦显微镜（Zeiss，Jena，Germany）配备：
用于漂白所选区域的声光可调滤波器（AOTF）
用于活细胞成像的加热室（37℃）
可调谐双光子激光器（700-1100nm，> 2,000mW功率，Chameleon Laser，Coherent Inc.）
30 mW氩激光（458,48和514 nm激光线）
一个60x的目标，1.4 NA油计划疏散（蔡司）浸没镜头
用于使用488nm激光线的二向色和发射滤光片，并检测GFP荧光
玻璃底盘，1.5号盖片（直径35mm，MATTEK，目录号：P35G-1.5-20-C或29mm直径，Shengyou Biotechnology，目录号：D29-10-1.5-N）

软件

ImageJ软件（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
斐济软件（ http://imagej.net/Fiji ）
MTrackJ pluging（ http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/）
Microsoft Excel（ https://products.office.com/en-au/excel ）
GraphPad PRISM软件（ http://www.graphpad.com/scientific -software/prism/）

程序

细胞制备
GFP标记的蛋白质标记细胞 - 细胞连接的表达可以通过使用基因组编辑工具如CRISPR，病毒转导（参见Priya和Gomez，2013）或者编码连接蛋白融合的质粒的瞬时转染来内源性标记感兴趣的基因来实现使用Lipofectamine 3000，如下所述（参见附录I ）。
注意：质粒的过表达不应导致任何功能增益和/或改变细胞的生理（即形态的突然变化）。
1. 用E-钙粘蛋白-GFP构建体电镀和转染细胞
图像采集
注意：
1. 对于使用多光子激光器，请仔细阅读与其使用相关的安全注意事项（附录IV ）
2. 对于反冲测量，请确保分析具有一致水平的E-钙粘蛋白-GFP构建体的细胞。理想的过表达水平应该保持在最低限度以防止过度表达伪像（另见附录I ），并与活细胞成像兼容。
1. 一旦识别出目标细胞，在（2帧）之前和之后（5帧）获得感兴趣的区域中的GFP荧光的延时图像为270×270像素，0.1860119μm/像素（在4倍数字变焦，0.8μm光学部分），或直到观察不到连接长度的更多变化，〜1分钟）。以1-3％透射率的氩激光器（30mW）的488nm激光线以8秒的时间间隔采集总时间为44秒的图像（图2A和2B; 补充视频1 ; 附录II ）。
  注意：该感兴趣的区域足以获得单个细胞 - 细胞连接以分析其消融后的长度变化，而不需要获取整个视野（512×512像素，图2A），其将减慢可以监测连接反冲的速度。
2. 2.8×1.7μm的恒定感兴趣的区域，长轴平行于细胞 - 细胞接触（图2A）被标记为消融，使用30次迭代的变色龙激光器，其在790nm具有40％的透射率（参见补充视频1 和附录II ）。这导致了有效的消融而没有明显的细胞损伤（图2B，另见补充视频2 ，对于细胞损伤重要的情况）。
  注意：对于量化和统计分析，在至少3次独立实验中，每个实验每个条件重复15至25次采集程序（参见图14）。
  
  图2.消融实验期间获取的感兴趣区域和消融前后结点的代表性静止图像。 A。用于激光消融的不同兴趣区域的方案和连接张力的测量; B.激光切割实验的电影静脉切片，以测量细胞细胞连接处的张力。黄线：激光消融前顶点的原始位置;红线：顶点的实时位置;箭头：消融部位。
激光功率的优化和消融步骤的迭代（参见附录V ）。
注意：这种优化应该使用表达优选的连接标记的感兴趣的细胞系，使用激光共聚焦显微镜进行有效检测，并执行时间延迟成像。如果标记物过度表达，实验者应尽量以足够的成像表现，并避免由于过度表达引起的任何功能影响。
1. 为了建立这个优化步骤，必须从在它们的连接点处具有张力的细胞开始，因为成功的消融将导致连接点的可观察到的伸长，即，定义它的顶点的反冲（补充影片1 ，<一个class ="ke-insertfile"href ="https://en-cdn.bio-protocol.org/attached/file/20161130/20161130212644_8538.docx"target ="_ blank"> 2 和 4 ）。
2. 在实践中，使用大量迭代（> 20并且如果需要增加更多）和高激光功率（约70％，如果需要增加更多）进行消融设置的初始测试。在这些恶劣条件下，应该观察到明显的细胞损伤，这将显示出红外激光的激光功率是有效的，并且它被正确地准直（参见附录III ，补充视频3 ）。
3. 一旦达到此目的，可以获得细胞膜损伤最小的设置。这可以通过在表达细胞质mCherry的细胞和不具有细胞质的细胞之间进行另外的控制来消除结合（标记为顶端连接标记）。
  在这些条件下，应该可以进行消融实验，其中观察到可观察的反冲，但是没有观察到从一个细胞到另一个细胞的mCherry荧光的显着流动（参见补充视频2 和 3 ）。
4. 此外，通过GFP荧光图像获取DIC图像，可以检查激光功率是否不会太高，造成损害。

数据分析

图像分析
1. 测量顶点之间的距离随时间的变化
  1. 一次在ImageJ软件中打开获得的延时图像（每个实验每个条件为n = 15 - 25）。如果在每个时间点获取Z-stack，则图像噪声较大时，应使用中值滤波器（1像素），并应用最大投影。
  2. 使用MTrackJ插件来测量消融后的细胞 - 细胞结的应变或变形ε（t）作为时间的函数。特别是，使用这个插件，我们跟踪定义消融结点随时间推移的每个顶点的XY坐标（参见位于 http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/）。然后，将X和Y值复制到Excel表中。对于每个烧蚀点，我们将获得4列：X（上），Y（顶），X（底）和Y（底部）和n行，其中n是电影中存在的时间点数（从6到20，取决于系统到达高原的速度）。
2. 使用由MTrackJ插件生成的跟踪数据，计算每个时间点t的联系人L（t）的长度为：
  
  在Excel中可以使用以下公式
  完成
  L（t）= sqrt（（Xtop（t） - Xbottom（t））^ 2 +（Ytop（t） - Ybottom（t））^ 2） ; （方程2）
3. 然后在每个时间点（行）处测量消融后的反冲或应变ε（t）的量作为任何时间[L（t）]与消融前接触长度之间的接触长度之间的差值[L （0）]
  （ t ）= L （ t ） - L （0）（等式3）
4. 图3示出了使用等式3.绘制20次消融的平均后坐值（另见补充文件1）。
  
  图3.在时间= 0时ε（t），顶点分离减去顶点分离的记录。图是分析的20个连接点的平均值。误差棒是±SEM（参见补充文件1）。
数据拟合：提取初始反冲和k值
原理：在消融实验的时间尺度内，如果连接应变在消融后表现出具有确定的平台的单一指数生长，则可以将其建模为开尔文 - Voigt纤维（Fernandez-Gonzalez等人，2009）通过将其拟合到以下等式

哪里，
F <0>是存在于消融之前的结处的拉伸力，
E是连接点的弹性，
μ是与细胞质粘性阻力相关的粘度系数作为上述方程的拟合参数，我们引入了

和
1. 从拟合结果可以提取两个量：初始反冲，这是消融前接头处的潜在收缩张力的测量值，k值是介质的连接弹性和粘度之间的比值。
  注意：当在不同的条件下进行烧蚀时，初始后坐力的变化，而不是k值的变化强烈地表明交界处的张力受到影响。相比之下，初始反冲和k值的同时变化更难解释。对于最后一种情况，首先需要对细胞细胞连接处的物理张力（即力的量）进行推断以获得连接弹性（或刚度）的独立测量。这可以例如使用原子力显微镜或光学镊子来完成。然后使用弹性值或刚度值从激光烧蚀实验μ= values获得的k值计算μ。然后，以这种方式获得的μ值，即使在弹性和/或粘度的条件下，也可以计算消融前的细胞 - 细胞结上的平均力量（F <0> =初始反冲*μ）被修改。
  反冲数据的拟合（等式3）可以使用GraphPad PRISM软件完成。图4-14中显示的快照的文件被提供为补充文件1 。要开始分析，首先创建一个新的XY表项目，其中输入复制Y（n = 20到30）值并为每个时间点绘制（图4）。
  
  图4. GraphPad PRISM对话窗口的快照，用于创建用于分析连接反冲数据的新XY项目
2. 然后将Excel中获得的ε（t）值（方程3，参见图像分析部分的步骤A1-A4）粘贴到GraphPad PRISM表中（图5，另见数据表：补充文件1 与...一起提供这个协议）。
  
  图5.包含来自实验的反冲数据的XY表的快照。 X列包含获取图像的时间（以秒为单位）的值。时间= 0秒对应于消融前获取的时间点。 Y分量对应于从控制单元（等式3）导出的ε（t）数据，该数据分组在A组内。值A：Y1，A：Y2，A：Yn对应于来自单个结的反冲值被烧了另见补充文件1 。
3. 使用该软件通过插入→现有数据的新图→平均值±SEM绘制平均ε（t）值（图6）。
  
  图6. GraphPad PRISM中的'创建新图形"窗口的快照，用于绘制回冲结果
4. 然后通过转到"非线性"按钮执行拟合（图7）。这将打开一个具有不同选项的新窗口，以使用已经可用的方程式或创建拟合数据的新方程式。请注意，对于以下步骤，可以使用GraphPad Prism阅读有关非线性回归的一般准则： http://www.graphpad.com/guides/prism/7/curve-fitting/index.htm?reg__curve_fitting_with_prism_6 .htm
  
  图7. GraphPad PRISM软件中拟合分析选项的快照
5. 在新的对话窗口中，创建一个新的拟合方程（图8）
  
  图8. GraphPad Prism软件中的非线性拟合菜单的快照
6. 在"公式"菜单中（见图9的顶部）
  
  图9.在GraphPad PRISM的非线性函数中添加初始反冲测量方程
  1. 为新方程分配名称，例如"激光纳米刀"。
  2. 在"定义"字段中粘贴以下公式：
    
    Y =（initialrecoil/K）*（1-exp [-K * x]）（另见图9）
  3. 然后，在同一窗口中进入下一个选项卡"初始值规则"，并为拟合参数的初始值选择以下条件（图10）。
  4. 转到"默认约束"选项卡，为拟合参数初始反冲和k分配大于零的值（图11）。
  5. 清除要在此窗口的最后一个选项卡中报告的任何转换（转换为报告，图12）。这些分析不再需要。
  6. 按"确定"按钮接受所有更改。
  7. 拟合数据（最小二乘法和未知数插值）。您将获得具有配件结果的表（图13）。
    
    图10."GraphPad PRISM"非线性回归菜单中的反冲测量参数的初始值规则
    
    图11.使用非线性回归
    对反冲数据拟合参数的默认约束的定义
    
    图12.非线性回归分析中"创建新方程"窗口中的"转换为报告"菜单
    
    图13.来自反冲数据的非线性回归的结果的快照，显示初始反冲和k 的值
  8. 将结果复制到不同的"初始反冲"（3 ^rd行，另见图13）和'k'值（4 ^th行结果）其标准错误（分别为SD，第6和第7行），并将它们粘贴到GraphPad PRISM中的另一个工作表中（参见补充文件1 ，另见图14）。从那里可以计算来自不同条件和独立实验（不同日期）的初始反冲和k值的平均值，并在这些实验之间进行统计测试，以评估反冲速度的差异（即，张力）。
    
    图14.具有初始反冲值的表及其从反冲数据的非线性回归分析获得的错误。这里将数据粘贴到GraphPad PRISM文件中的新分组表中（另见此PRISM文件作为补充文件1 提供;对于此协议）。
  9. 从上述模型可以看出，假设粘度在它们之间没有显着差异，可以通过比较不同条件下的初始反冲值来估计出现在接合处的拉伸力的差异。为了评估这些假设在这些实验中是否有效，计算不同条件之间的速率常数k是非常重要的，因为如果接头的粘度或弹性明显改变，这将会发生变化。在不同实验条件（通过测试或单向方差分析评估）之间，k值没有显着变化表明，拉力的变化是初始反冲速度变化的主要贡献者。 >

食谱

成像媒体
Hank的平衡盐溶液补充有10mM HEPES pH 7.4和5mM CaCl 2

致谢

该协议改编自我们实验室（Ratheesh等人，2012; Michael等人，2016）的先前工作。在IMB/ACRF癌症生物学成像设施下进行共聚焦显微镜检查，并在澳大利亚癌症研究基金会的大力支持下建立。我们还感谢John Griffin和Darren Paul就使用脉冲激光器的安全考虑提供了建议。

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