材料和试剂

方格培养皿（120 x 120）x 17带通风口（Greiner Bio One，目录号：688102）
圆形培养皿，94 x 16通风口（Greiner Bio One，目录号：633180）
滤纸，例如，Rotilabo圆形过滤器，113A型，125mm（Carl Roth，德国）
50ml管（Cellstar管）（Greiner Bio One，德国）
手术3M微孔胶带（3M德国，德国）
铝箔
盖玻璃
可拆卸的粘合标签，例如，多功能标签（Avery Zweckform，德国）
水稻（za iva>> j ica ica ica ica ica ica ica ica ica ica>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 注意：本研究中使用的栽培品种Nipponbare由国际农业研究中心（CIRAD，Montpellier，France）提供。
大麦（Hordeum vulgare ）易受的影响。
注意：本研究中使用的Cultivar Ingrid由Paul Schulze Lefert（德国科隆Max-Planck植物育种研究所）提供。
丝核菌（Rhizoctonia solani）
注意：本研究中使用的分离物NL84由MonicaHöfte（根特大学，根特，比利时）提供。
腐霉腐霉
注意：本研究中使用的隔离物132由MonicaHöfte（根特大学，根特，比利时）提供。
Blumeria graminis f。 sp。 hordei。
注意：在本研究中，使用了K1（Hinze等，1991），由Paul Schulze-Lefert（马克斯·普朗克植物育种研究所，德国科隆）提供。
土豆提取物葡萄糖琼脂（PDA）（Carl Roth，德国）
蒸馏水
含有维生素的Gamborg B5培养基（Duchefa Biochemie，目录号：G0210.0025）
琼脂，神户一（Carl Roth，德国）
次氯酸钠（或市售的漂白水，"Eau de Javel"）

设备

剪刀，手术刀
用于水稻种植的植物生长室（设置：15小时灯/9小时黑暗时期，24℃，75-80％湿度）
植物生长箱用于常规繁殖（设置：16小时灯/8小时黑暗时期，18℃，65％湿度）
用于维护真菌培养物的培养箱（22°C，恒定黑暗）
卧式摇床
Thoma细胞计数室（Marienfeld，德国）
光学显微镜（约150倍放大）
接种的托盘（最小30 x 15厘米^{2）
注意：面积应至少对应于两周龄水稻植物的大小。}
孢子沉降塔（例如，，高约1米的塑料帐篷，顶部有接种开口，参见图3C中的示例）

程序

接种立枯丝核菌的方案

solani 接种。 A.典型的 R。在培育7天后，PDA上的solani 文化。 B.四周龄的水稻植株，四叶完全膨大。 C.四周龄水稻，第四叶充分膨大（叶数）。 D.将大米叶放置在滤纸上，并用长满大块的琼脂块接种。 solani 。 E.在接种的叶上发育的坏死病变的实例。
1. 培养 R。 solani在土豆提取物葡萄糖琼脂（PDA）上在22℃下在黑暗中。为了维护，每两周将带有真菌菌丝体的琼脂块转移到新鲜的PDA板上。对于接种，使用 R。分蘖后七天（图1A）的solani 文化
2. 种植水稻约为4周直到第四叶充分膨胀（图1B和1C）
3. 准备内置滤纸的方格培养皿（12 x 12厘米）。用蒸馏水润湿滤纸。
4. 切掉不同水稻植物的第四个叶子的上部10厘米，并立即将其放在潮湿的滤纸上
5. 切割来自7天龄的真菌菌丝体的小琼脂块（约0.5×0.5厘米）。 solani 文化。对于接种，将一个琼脂块放在每个稻叶的中间（图1D）
6. 孵化培养皿与接种的叶子在植物室。避免用蒸馏水润湿滤纸来干燥叶子（注1）
7. 接种后4天内观察坏死性病变（图1E）的发展情况
葛根腐霉的接种方案

图2. < graminicola 接种。 A.典型的。培养七天后，在PDA上培养禾本科植物。 B.接种有琼脂块的Gamborg B5培养基上的水稻幼苗，其中长满了P. graminicola 。
1. 培养P。 graminicola 在土豆提取物葡萄糖琼脂（PDA）中在22℃下在黑暗中。为了维护，每两周将含有真菌菌丝体的琼脂块（约0.5 x 0.5厘米）转移到新鲜的PDA板上。对于接种，请使用P.分蘖后7天培养禾本科植物（图2A）
2. 在Gamborg B5培养基中准备含1.5％琼脂的方形培养皿（12 x 12厘米）。
3. 将米粒填充在50ml管中，加入4％次氯酸钠进行表面消毒，摇动10分钟。随后用无菌蒸馏水洗三次
4. 在一个Gamborg B5琼脂平板上放置3-6粒种子。
5. 用3M微孔带密封板，并用铝箔覆盖保护根生长。
6. 将板直立放置在植物生长室中（条件见上文），直到根长出长约ca。 1厘米（约5天后）。
7. 对于接种，从7天龄的边缘区切下小琼脂块（约0.5×0.5厘米）。 graminicola 文化。在相邻植物的根之间放置一个琼脂块（图2B）。如前所述，在生长室中孵育平板。
8. 接种后1〜2周监测疾病发展情况
f。Blumeria graminis的接种方案f。f。 sp。 hordei （ Bgh ）

图3. 接种。A.将二周龄的水稻植物与第二叶固定在托盘上。 B.大麦感染的大麦植物（原生叶上有白色白粉病脓疱）。 C.用于接种的沉降塔的实施例（将植物固定在放置在塔底部的托盘上）。在顶部，可以看到可以将感染的大麦植物引入塔中的开口。

由于真菌是专性生物体，因此必须在与试验植物分离的生长箱中的大麦植物上进行维持。通过从严重感染的大麦植物中摆脱分生孢子，将Bgh 每周转移到新鲜的一周龄植物中（图3B）。

在土壤中种植大米植物约2周直到第二叶充分膨胀。使用平方的植物盆，以便于在接种盘上稳定地固定（参见步骤C4）。

在接种前一天，通过摇晃从大麦植物中除去老的分生孢子（注2）。

对于接种米饭，将植物盆横向放置在托盘上，通过在每个叶片的顶端和底部放置2-3毫米可移除的粘合剂标签条，将每个植物的第二叶子（近轴表面）固定在托盘上（注3，图3A）

将固定叶片旁边或两侧的Thoma细胞计数室（无盖玻片）放置，以监测接种密度

用沉淀塔盖住托盘（图3C）。

对于接种，将感染的大麦植物的叶子或整个植物盆轻轻地转移到沉降塔的开口处，并通过摇动将新鲜出现的分生孢子释放到塔中。随后，在沉降塔的空气空间内用小托盘挥动，引起湍流，均匀分配分生孢子。

让分生孢子定居30-60分钟。

在托马计数细胞上涂上盖玻片，用显微镜确定孢子密度。因此，计算两个房间的大中央正方形（在标准Thoma室中为1 mm ²）的分生孢子，并取平均值。在我们的实验室条件下，1-5个孢子mm ^-2可能导致明显的宏观可观察到的霉菌脓疱， 15-20孢子mm ^-2推荐用于显微镜评估。如果孢子密度太低，返回步骤C5。

轻轻地从米叶中取出粘合剂标签，抬起锅并将其转移到植物生长室。

在宿主植物上，可以在接种后的第一周内观察到第一次白粉病脓疱（如图3B所示）。由于大米是一种不育植物，因此必须通过显微镜来评估感染过程。

数据分析

接种的植物的分析可以通过宏观或微观评估进行（如在Weidenbach等人，2016中所述）。

笔记

小心避免叶子和真菌接种物的"淹水"。
这一步确保新鲜的接种物，因为毒力不同的老的分生孢子已经枯竭了。
通过将叶片的位置固定在托盘上，可以进行均匀的接种。

致谢

我们感谢MonikaHöfte提供 R。 solani 和 P。 graminicola 分离，并在各自的接种方法中为她提供建议。 Weidenbach等人（2016）中使用和描述了这里提供的所有协议，其第一作者是在BMBF资助活动"未来植物生物技术"（Plant Biotechnology for the Future，BASANT 2030）的框架内资助的项目"BarleyFortress"。

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