材料和试剂

100mm培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：351029）
聚丙烯管：
2ml管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-200-C）
5 ml管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-500-C）
离心管：
15 ml管（Corning，Falcon ^®，目录号：352096）
50ml管（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
细胞过滤器：
5 ml聚苯乙烯管，带细胞过滤器扣帽（35μm尼龙网）（Corning，Falcon ^{®，目录号：352235）
70μm尼龙网（Corning，Falcon ^®，目录号：352350）}
细胞分离柱：
MS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
LS列（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
聚-L-赖氨酸涂层载玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：10143265）
ART ^TM屏障铰链机架吸头提示
P1000（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2079-HR）
P200（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2069-05-HR）
P20（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：2149-05-HR）
C57BL/6N小鼠（BioLASCO，目录号：C57BL/6N）
Hank的平衡盐溶液（HBSS），钙，镁，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14025092）}
汉克平衡盐溶液（HBSS），无钙，无镁，无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14175095）}
IV型胶原酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：17104019）}
DNase I（不含RNase）（New England Biolabs，目录号：M0303）
抗体：
生物素大鼠抗小鼠CD90.2（克隆30-H12）（BD，目录号：553011）
生物素大鼠IgG2b，κ同种型对照（克隆A95-1）（BD，目录号：553987）
抗CD90.2生物素抗体（批号5150211128）（Miltenyi Biotec，目录号：130-101-908）
抗CD49f抗体（BD，目录号：551129）
同种型抗体（阴性对照）（BD，目录号：551066）
抗PLZF抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-28319）
抗VASA抗体（Abcam，目录号：ab13840）
AffiniPure驴抗兔IgG（H + L）（Alexa Fluor） 488）（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-545-152）
AffiniPure驴抗小鼠IgG（H + L）（Alexa Fluor 488）（Jackson ImmunoResearch，目录号：715-545-151）
抗生物素微珠（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-485）
PFA（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
牛血清白蛋白（BSA），无IgG和无蛋白酶（Jackson ImmunoResearch，目录号：001-000-162）
正常驴血清（Abcam，目录号：ab7475）
EDTA，0.5M，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，Anbion ^{TM，目录号：AM9260G）}
BSA
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），不含钙，无镁（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190144）}
胰蛋白酶-EDTA，0.25％，酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：16000044）}
PE-Cy5缀合的抗体
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
E-HBSS（见配方）
MACS缓冲区（见配方）
胶原酶溶液（参见食谱）
胰蛋白酶溶液（参见食谱）
F-MACS缓冲区（见配方）
染色缓冲液（见配方）
FACS缓冲区（见配方）
PBST（见配方）

设备

灭菌镊子和剪刀
解剖显微镜（Leica MZ16F立体显微镜）
P1000移液器
离心机
血细胞计数器
磁分离器
用于MS列的OctoMACS ^{TM分隔符（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-109）
用于LS列的MidiMACS ^{TM分隔符（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-302）}}
Beckman Coulter FC500细胞仪（Beckman Coulter，型号：FC500）
Leica TCS SP5 II共焦显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP5 II）

程序

睾丸收集和单细胞悬浮液
1. 使用灭菌镊子和剪刀从小鼠中取出睾丸。在含有10毫升冰冷HBSS的100毫米培养皿中收集睾丸。
2. 从解剖显微镜（见图1A，上图），从睾丸中取出白膜以暴露生精小管。将生精小管块转移到含有10ml冰冷HBSS的新的100mm培养皿中。将生精小管置于冰上。
3. 使用冰冷的HBSS清洗生精小管团块，以清除碎片和悬浮细胞
4. 为了估计生精小管团的粗大体积，我们将这些团块转移到2ml聚丙烯管中以计算体积。然后，将生精小管块转移到含有至少3倍生精小管的体积的室温胶原酶溶液的新培养皿中，补充有1mg/ml IV型胶原酶和5U/ml DNase I以除去间质Leydig细胞，血液细胞和管周细胞，分别从死细胞中消化基因组DNA（见注1）注意：我们通常从五只一周龄的小鼠中收集0.2-0.3ml生精小管团块，加入1ml胶原酶溶液，从五只4周龄小鼠中获得1-1.5ml生精小管团块，并加入6 ml胶原酶溶液。
5. 在室温（〜25°C）的20分钟内，用解剖显微镜在镊子内松开生精小管，以避免长时间的酶孵育（图1A，下图）。
  视频1中显示了睾丸采集，精液清除和生精小管松动的程序。
  
  <！ - flashid2072v140开始 - >
  视频1.从4周龄小鼠（步骤A1-A5）的睾丸采集，去除白细胞并清除生精小管松动
  
  <！ - flashid2072v140结束 - >
6. 使用至少3倍体积的室温E-HBSS洗涤并清洁分散的生精小管20秒，同时以30rpm的温和水平摇动。
7. 去除E-HBSS，加入3倍体积的胶原酶溶液，并在37℃下孵育20分钟。
8. 丢弃上清液并通过加入3倍体积的室温E-HBSS洗涤分散的生精小管20秒，同时以30rpm的温和水平摇动。
9. 用室温E-HBSS缓冲液重复该洗涤过程五次，持续20秒，以30rpm的温和水平摇动除去悬浮细胞。
10. 将生精小管转移到2毫升聚丙烯管（或执行大量样品时为5毫升聚丙烯管）。加入5倍体积的补充有5U/ml DNA酶I的室温胰蛋白酶溶液。使用具有切割尖端的P1000移液管上下移液以机械切碎生精小管以获得单细胞悬浮液（图1B）。
11. 在37℃下孵育组织3分钟注意：在10分钟内执行该反应（步骤A10和A11）很重要，因为延长的胰蛋白酶溶液孵育可能导致细胞表面蛋白质的蛋白水解切割（见注2）。
12. 加入3倍体积的室温F-MACS以猝灭胰蛋白酶反应（见注3）
13. 将悬浮细胞转移到新的50ml离心管中
14. 使用70μm尼龙细胞过滤器去除残留组织并过滤悬浮液。在加入细胞悬液后，用2倍体积的室温MACS缓冲液洗涤细胞过滤器。
15. 在4℃下以300×g离心细胞悬液10分钟。
16. 将细胞重新悬浮在冰冷的MACS缓冲液中，并用血细胞计数器计数细胞数（见注4）。
一周龄睾丸细胞的细胞标记和磁分离
1. 在4℃下再次以300×g离心10分钟并吸出上清液。将细胞重新悬浮在100μl冰冷的MACS缓冲液中，并从一周龄小鼠分离的每10个细胞中加入10μl生物素缀合的抗CD90.2（THY1）抗体。我们每100μl冰冷的MACS缓冲液使用约5μg抗体。
2. 通过温和移液进行良好的混合，并在30℃下以4℃静置15分钟（见附注5）。
3. 通过加入等体积冰冷的MACS缓冲液洗去未结合的一抗
4. 在4℃以300×g离心细胞悬浮液10分钟。
5. 重新悬浮细胞并再次用2ml冰冷的MACS缓冲液/10μg/ml细胞洗涤并在4℃下以300×g离心10分钟。
6. 完全吸出上清液，并将细胞重新悬浮在80μlMACS缓冲液中，每10个细胞添加20μl微珠（Miltenyi Biotec）。
7. 通过温和移液混匀并在4℃下温和旋转30分钟温和旋转15分钟。
8. 通过加入2ml MACS缓冲液/10μg/ml细胞洗涤并在4℃下以300×g离心10分钟。
9. 完全吸出上清液，并在1ml冰冷的MACS缓冲液中再悬浮至10μg/ml细胞。
10. 通过35μm尼龙细胞过滤器通过睾丸细胞去除细胞团。与胰蛋白酶处理后的细胞数相比，大约10％的细胞丢失（步骤A16）。
11. 将MS柱放在磁选机上。通过用500μl冰冷的MACS缓冲液冲洗，准备MS柱（Miltenyi Biotec）进行细胞分离。
12. 将细胞悬浮液应用于制备的MS色谱柱（见附注6），并每30秒轻轻移液一次，以避免细胞在通过色谱柱之前沉降和聚集。这样可以确保各个细胞能够流畅地通过色谱柱。
13. 收集通过的未结合的细胞，并用500μl冰冷的MACS缓冲液洗涤柱子三次。这些细胞可以作为样本，以测试从亚群中除去THY1 ⁺细胞的效力，或作为THY1阴性对照组。
14. 从磁选机中取出MS柱，并将其置于新的15 ml离心管上
15. 将1ml冰冷的MACS缓冲液加入MS柱中，以洗脱THY1 ⁺细胞。
16. 通过使用柱提供的柱塞收集磁性标记的THY1 ⁺细胞（参见注释5和7;图1E-1M，用于生殖细胞纯度和活/死细胞比）。
4周龄睾丸细胞的细胞标记和磁分离
1. 在4℃下再次以300×g离心10分钟并吸出上清液。将细胞重新悬浮在1ml冰冷的MACS缓冲液中，并从4周龄小鼠分离的每10个细胞添加20μl生物素缀合的抗CD90.2（THY1）抗体。每1毫升冰冷的MACS缓冲液中有约10微克抗体。
2. 通过轻轻移液进行良好的混合，并以30rpm的温和旋转在4℃温育15分钟（见注5）。
3. 通过加入等体积冰冷的MACS缓冲液并在300℃下离心细胞悬浮液在4℃下洗涤10分钟进行洗涤。
4. 重新悬浮细胞并再次用2ml冰冷的MACS缓冲液每108个细胞洗涤并在4℃下以300×g离心10分钟。
5. 完全吸出上清液，并将细胞重新悬浮在1ml冰冷的MACS缓冲液中，每10个细胞添加40μl微珠（Miltenyi Biotec）。
6. 通过轻轻移液混匀，并在4℃温育15分钟，以30rpm的温和旋转。
7. 用2ml冰冷的MACS缓冲液/10μg/ml细胞洗涤，并在4℃以300×g离心10分钟。
8. 将上清液完全吸入，并在1ml冰冷的MACS缓冲液中重新悬浮至10μg/ml细胞。
9. 将细胞通过35μm尼龙细胞过滤器，以去除细胞团块
10. 将LS柱放在磁选机上。用2ml冰冷的MACS缓冲液冲洗，制备LS柱（Miltenyi Biotec）
11. 将细胞悬浮液应用到制备的LS柱上（见附注6），每30秒轻轻移液一次，以避免细胞在通过柱子之前沉降和聚集。这样可以确保各个细胞能够流畅地通过色谱柱。
12. 收集未通过标记的细胞，并用2ml冰冷的MACS缓冲液洗涤柱子三次。这些细胞可以作为样本，以测试从亚群中除去THY1 ⁺细胞的效力，或作为THY1阴性对照组。
13. 从磁选机中取出LS柱，放在新的15 ml离心管上
14. 将2ml冰冷的MACS缓冲液加入LS柱，以洗脱THY1 ⁺细胞。
15. 通过使用柱提供的柱塞收集磁性标记的THY1 ⁺细胞（参见注释5和7;图1E-1M，用于生殖细胞纯度和活/死细胞比）

数据分析

通过这里描述的精确方案分离的样品的所有分析结果（廖等人，2014; Tseng等人，2015）分别由三到八个独立实验。
大多数分离的8dpp THY1 ⁺细胞（〜80％）显示出核周PLZF分布（Tseng等人，2015），表明该亚群是相对静止的（Buaas < ，2004年; Costoya等人，2004）。
来自该协议的全部隔离细胞的85％以上表现出PLZF和VASA信号。 PLZF被认为是未分化精原细胞的标记，VASA在所有生殖细胞中表达。通过该分离方案，富含SSC的初级生殖细胞（无培养）的高纯度适用于全基因组高通量转录组和表观基因组分析（Liao等人，2014; Tseng等人。，2015）。
为了免疫染色的质量控制，使用来自 luxoid（ZBTB16 ）突变小鼠的样品作为阴性对照以验证PLZF抗体的特异性。 VASA表达生殖细胞和非VASA表达体细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）用作阳性和阴性对照以验证抗VASA抗体的特异性。使用来自IgG对照的最强信号强度（仅二次抗体）作为背景噪声的截止线

代表数据

图1.使用磁激活细胞分选的产后小鼠睾丸的生殖细胞富集A.睾丸分散的生精小管，用于有效去除生精小管外的体细胞。上图显示无精囊白细胞的生精小管团块。下图显示分散的生精小管。 B.使用高效胰蛋白酶溶液的单细胞悬浮液（粉红色，上图）。在显微镜下，下面板显示胰蛋白酶处理后的单细胞悬液。 C.用台盼蓝染料处理每批分离的THY1 ⁺细胞以计算细胞死亡的百分比。在相差显微镜下可以识别未染色的活细胞（例如黄色箭头）。红色箭头表示死细胞的黑色。 D.用同种型抗体标记的分离的8dpp THY1 ⁺细胞的流式细胞术分析（上图）和用PE-Cy5缀合的抗CD49f抗体（下图） 8）。例如。使用单克隆抗PLZF抗体免疫染色分离的8dpp THY1 ⁺细胞。绿色，PLZF;蓝色，Hoechst 33342.刻度棒=60μm。 H-J。在80％分离的8dpp THY1 ⁺细胞中的PLZF（绿色）亚细胞定位模式。绿色，PLZF;蓝色，Hoechst 33342.刻度棒=2.5μm。 K-M。使用抗VASA抗体免疫染色分离的4周龄THY1 ⁺细胞。 VASA主要位于细胞质中。绿色，VASA;蓝色，Hoechst 33342.刻度棒= 25μm（见注9）。

笔记

THY1表现在各种细胞类型，包括造血细胞，上皮细胞和成纤维细胞。在睾丸中，细胞在生精小管外显示THY1表达（Kubota等人，2004b; Rege和Hagood，2006）。因此，彻底去除生精小管之外的体细胞THY1 ⁺细胞对于分离的THY1 未分化精原细胞的纯度是重要的（步骤A4-A9）。
胰蛋白酶处理可能导致表面蛋白质的蛋白水解切割。为了最小化这个缺点，当有大量的睾丸时，将样品分成几组。将F-MACS处理的单细胞悬浮液通过70μm尼龙细胞过滤器过滤后保存在冰上。如果细胞结块或如果反应溶液从粉红色变成黄色，再添加更多的胰蛋白酶溶液，再次移液以达到单细胞悬浮液（图1B）。
将F-MACS缓冲液预温至室温以最小化细胞团聚。
当每个实验使用五个产后小鼠时，通过该方案获得的睾丸细胞在8dpp处约为1-1.3×10 6个细胞/睾丸，约0.7-1×10 7个/每个睾丸为4周龄小鼠。出生日期定义为0 dpp。
在4℃下更长的抗体孵育30分钟可以提高THY1 ⁺细胞的回收率;然而，它也增加抗CD90.2抗体与体细胞的非特异性结合（Liao等人，2014）。根据我们的经验，未分化精原细胞的分离效率和纯度随着不同批次的生物素缀合的抗CD90.2抗体而显着变化。例如，在有经验的手中，当使用Lot 25136和Lot 80806的生物素标记时，CD49f ⁺或PLZF ⁺生殖细胞的比例大于总分离细胞的85％共轭抗CD90.2抗体（BD Pharmingen;图1D-1G），而总分离细胞的PLZF ⁺比率为60％至85％，批号为3032695，Lot 5152843和Lot 6110644为抗CD90.2抗体（BD Pharmingen）以及抗CD90.2Biotin抗体（Miltenyi Biotec，Lot 5150211128）。当应用较不优选批次的抗CD90.2抗体时，生殖细胞的减少的比例可能是由于使用抗VASA抗体（生殖细胞标记）免疫染色后基于增加的VASA阴性细胞的体细胞污染（图1K -1M）。
另外，由于在成年睾丸中存在更多的THY1 ⁺体细胞，所以将该方案应用于从成年小鼠中分离THY1 ⁺未分化精原细胞可能存在缺点（久保田和布林斯特，2008）。
为了进行有效的细胞分离，MS柱的典型细胞数量应该小于每列5×10 7个睾丸细胞，LS柱的细胞数应小于5×10 7 sup> 8 睾丸细胞。
死细胞通常小于通过台盼蓝染色确定的总分离的THY1 ⁺细胞的10％（图1C）。在4℃下以300×g可选离心10分钟可有效去除死细胞。
通过流式细胞术分析磁性分离的THY1 ⁺细胞。使用PE-Cy5缀合的抗CD49f抗体和同种型抗体进行该分析。重新悬浮THY1 ⁺细胞，并在黑色染色缓冲液中在冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤两次并通过35μm尼龙细胞过滤器过滤后，通过Beckman Coulter FC500 Cytometer分析PE-Cy5缀合的细胞（图1D）。
对于免疫细胞化学分析，将分离的THY1 ⁺细胞置于聚-L-赖氨酸包被的载玻片（Thermo Scientific）上，并在室温下固定在4％PFA中10分钟。在室温下用PBST洗涤5次10分钟后，将细胞用2％BSA和5％驴血清在室温下封闭2小时，并在4℃下孵育过夜，随后进行一次抗体孵育：抗-PLZF抗体或抗VASA抗体。细胞用含有1％BSA的PBST洗涤三次。在室温下与二次抗体孵育1小时后，将载玻片在PBST中洗涤三次，用Hoechst 33342重新染色，并安装有载置介质。通过Leica TCS SP5 II共焦显微镜分析载玻片（图1E-1M）。

食谱

E-HBSS
2mM EDTA在HBSS中，无钙，无镁，无酚红
MACS缓冲区
2mM EDTA，DPBS中0.5％BSA
胶原酶溶液
1mg/ml IV型胶原酶和5U/ml DNase I在HBSS中
胰蛋白酶溶液
5 U/ml DNase I在0.25％胰蛋白酶-EDTA，苯酚红色
中
新鲜准备的F-MACS缓冲区
MACS缓冲区中的10％FBS
注意：将F-MACS放在冰上，然后将F-MACS缓冲液预热至室温（〜25°C），然后再使用。
染色缓冲液
1x DPBS
2 mM EDTA
2％热灭活FBS
PE-Cy5缀合的抗体（1：1000稀释）
FACS缓冲区
1x DPBS
2 mM EDTA
PBST
1x DPBS
0.2％Tween-20

致谢

作者衷心感谢李培龙先生，陈婉娴小姐及陈奕臣小姐进行有意见的讨论。这项工作得到台湾科技部（MOST 103-2321-B-002-099和MOST 104-2321-B-002-043）和台湾大学（NTU-105R4000）的资助。

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