材料和试剂

15厘米细胞培养皿
蛋白质LoBind ^®管（1.7ml管; OMNILAB-LABORZENTRUM，目录号：5409327）
50ml Falcon管（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
移液器提示
精细剂量注射器Omnifix-F（1 ml）（OMNILAB-LABORZENTRUM，目录号：5421736）
15 ml Falcon管（Corning，Falcon ^®，目录号：352096）
免疫印迹 PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：162-0177）
PD MidiTrap G-25（存储在RT）（GE Healthcare，目录号：28-9180-08）
过滤0.2μm（Sartorius，目录号16534-K）
富士X射线胶片RX，18 x 24厘米（Kisker Biotech，型号：RX1824）
Whatman印迹纸（Laborbedarf Lammel，目录号：3030690）
鼠肺泡巨噬细胞细胞系MH-S（ATCC，目录号：CRL-2019）
液氮
BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23225）}
生物素 - 环氧丙素（Bio-EP;溶于DMSO，-20℃下稳定至少12个月; Hermen Overkleeft Lab，Florea等人，2010）描述的合成）
二甲基亚砜（DMSO）（Carl Roth，目录号：A994.2）
HEPES（分子生物学级）（AppliChem，目录号：A3724,1000）
超纯水（例如，MilliQ）
链霉抗生物素蛋白珠（Strep-TactinSuperflow50％悬浮液;储存于4℃）（IBA，目录号：2-1206-010）
甲醇（AppliChem，目录号：A3493.1000）
Roti ^® - 封锁解决方案（在RT存储）（Carl Roth，目录号：A151.3）
抗β5抗体（-20℃储存）（Abcam，目录号：90867）
抗β5i抗体（-20℃储存）（Abcam，目录号：3329）
抗兔IgG，HRP连接抗体（-20℃储存）（New England Biolabs，目录号：7074S）
Amersham ECL主要蛋白质印迹检测试剂（存储在4°C）（GE Healthcare，目录号：RPN2232）
RPMI-1640细胞培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号11875093）}
胎牛血清（FBS）（Biochrom，目录号S 0615）
β-巯基乙醇（分子生物学级）（AppliChem，目录号A1108-100）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号15140122）}
Tris（缓冲液级）（AppliChem，目录号：A1379,1000）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（AppliChem，目录号：A1036,0500）
氯化钠（NaCl）（AppliChem，目录号：A2942,1000）
乙二胺四乙酸（EDTA）（AppliChem，目录号：A2937,1000）
叠氮化钠（NaN 3 3）（AppliChem，目录号：A1430,0100）
二硫苏糖醇（DTT）（分子生物学级）（AppliChem，目录号：A2948,0025）
三磷酸腺苷（ATP），二钠盐（10g）（Roche Diagnostics，目录号：10127531001）
甘油（87％）（分子生物学级）（AppliChem，目录号：A3739,1000）
cOmplete ^{TM蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）}
PhosSTOP ^{TM（磷酸酶抑制剂）（Roche Diagnostics，目录号：4906845001）}
十二烷基硫酸钠（SDS）（纯）（AppliChem，目录号：A1502,1000）
溴酚蓝（AppliChem，目录号：A2331,0025）
盐酸（发烟）（37％）（Sigma-Aldrich，目录号：258148-2.5L）
Rotiphorese ^{®凝胶30（37.5：1）（Carl Roth，目录号：3029.2）}
过硫酸铵（APS）（AppliChem，目录号：A0834,0250）
四甲基乙二胺（TEMED）（AppliChem，目录号：A1148,0100）
吐温20（Moleculare biology grade）（AppliChem，目录号：A4974,1000）
Dulbecco的磷酸缓冲盐水（1x DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190-144）}
MH-S细胞的完整生长培养基（见食谱）
TSDG缓冲区（见配方）
DMSO中的500μMBio-EP（参见食谱）
50 mM HEPES（pH 7.4）（见配方）
10％SDS（参见食谱）
6x Laemmli缓冲液（见配方）
4x SDS-PAGE分辨缓冲液（pH 8.8）（参见食谱）
4x SDS-PAGE堆叠缓冲液（pH 6.8）（见配方）
堆叠凝胶（参见食谱）
分解凝胶（15％丙烯酰胺）（见配方）
PBST（0.1％吐温）（见配方）

设备

Falcon管式离心机（Hettich Instruments，型号：Rotina 420R）
台式离心机（Hettich Instruments，型号：MIKRO 200R）
水浴（LAUDA，型号：Aqualine AL12 LCB 0725）
Thermomixer（Eppendorf，型号：Thermomixer comfort）
镊子
移液器
剪刀
Intelli-mixer旋转器（ELMI，型号：RM 2M）
Western印迹室（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini PROTEAN Tetra Cell）
电源（PowerPac ^TM基本电源）（Bio-Rad Laboratories，型号：1645050）
蛋白质印迹开发者（Agfa-Gevaert，型号：Curix60）
通风柜

程序

细胞材料的制备
1. 培养完整生长培养基中的MH-S细胞注意：该方案在从ATCC购买的鼠肺泡巨噬细胞细胞系MH-S（No.CRL-2019）中测试。以1:6至1:12的比例（分裂频率约3-5天）以70-90％细胞密度传代细胞。在处理前一天将12×10 6个细胞接种在15cm细胞培养皿中，但如果使用其它细胞系，则数量可能变化。关于细胞培养和治疗的进一步信息在Chen et al。（2016）。
2. 在室温下将收获的细胞和沉淀物在800×g下培养5分钟，除去上清液
3. 用PBS洗涤细胞，并在室温下以800 x g沉淀5分钟
4. 在400μlTSDG缓冲液中轻轻悬挂细胞。
  注意：TSDG缓冲液中的溶解有助于通过稳定蛋白酶体复合物来维持标准和免疫蛋白酶体活性。
5. Lyse细胞用液氮中的七个重复循环冷冻试管，并在室温下在水浴中解冻，直到晶体消失。
  注意：使用浮子有助于并行处理多根管。
6. 以14,000 x g离心20分钟，以除去细胞碎片，并将上清液转移到新鲜管中。
7. 确定蛋白质浓度（例如用BCA蛋白测定法，Bio-Rad）
8. 将样品储存在-80°C。
标准和免疫蛋白酶的ABP标记
1. 用生物素 - 环氧丙素（Bio-EP）治疗
  注意：Bio-EP是生物素化的ABP，其不可逆地结合标准和免疫蛋白酶体的活性催化亚基。
  1. 在冰上解冻细胞裂解物并将相当于500μg蛋白质的体积转移到1.7ml管中。
    注意：对于每个细胞裂解液，准备两个管。一个管用作媒介物对照，并与DMSO代替Bio-EP孵育。
  2. 用50mM HEPES（pH 7.4）填充高达500μl。最终的蛋白质浓度为1毫克/毫升
  3. 添加终浓度为5μM的Bio-EP（例如5μl500μM储备液），向对照管中加入相同量的DMSO。
  4. 孵育管在37℃下在Thermomixer上以600转/分进行120分钟。
    注意：同时，平衡排列色谱柱（步骤B2a-B2e）并准备下拉珠（步骤C1a-C1d）
  5. 用50mM HEPES（pH 7.4）加满1ml。最终的蛋白质浓度为0.5mg/ml 注意：SEC的体积为1毫升符合制造商的建议。
2. 大小排阻色谱（SEC）
  注意：执行SEC从样品中去除未绑定的ABP。自由ABP保留在柱树脂中，而大蛋白质如标准品和免疫蛋白酶体通过。对每个样品使用新鲜的PD MidiTrap G-25色谱柱。在车辆控制样品上执行SEC。
  1. 从列中取出顶盖，倒出储存溶液。
  2. 使用镊子去除树脂顶部的过滤器。
  3. 取下底盖，并使用制造商交付的蓝色适配器将色谱柱插入50ml收集管
  4. 用5毫升超纯水平衡柱2×，并丢弃流经。
  5. 用超纯水将色谱柱第三次填充，然后在离心机中以1000 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 注意：不要让色谱柱长时间干燥。在离心前盖上带有底盖的湿柱，以暂停平衡，直到所有样品准备应用。一旦所有样品准备就绪，取下盖子并离心剩余的液体以便使用方案恢复。
  6. 丢弃流经并将适配器的柱转移到标有样品名称的新鲜的50ml Falcon管上
  7. 在填充床的中间缓缓移液，并以1,000×g离心2分钟。
  8. 丢弃色谱柱并将含有洗脱液的50ml Falcon管储存在冰上。
ABP标记亚基的下拉
1. 链霉亲和素珠的制备
  注意：可以在ABP孵化期间完成（步骤B1d）。
  1. 将40μl50％链霉亲和素珠浆（=20μl珠）转移至1.7ml管中注意：转移前的涡流浆。使用200微升移液器，用剪刀切割移液器末端，否则珠子会堵塞吸头。
  2. 用500微升PBS清洗珠3×。在2,000 x g的洗涤步骤之间离心2分钟，弃去上清液注意：使用窄针头注射器，小心吸取上清液而不除去珠粒。针尖的直径必须小于珠径。
  3. 将小珠重新悬浮在1ml 50mM HEPES（pH 7.4）中，并将其转移到15ml Falcon管中。
    注意：将珠粒重新悬浮在500μlHEPES缓冲液中，并转移到15 ml Falcon管中。重复此操作以转移残余珠粒，从而防止珠粒损失。使用1000μl移液器，用剪刀切割移液器末端，否则珠子会堵塞吸头。
  4. 将珠存放在冰上，直至需要。
2. 标准溶蛋白和免疫蛋白酶
  注意：溶解是破坏复杂结构和允许分离ABP标记的非标记亚基所必需的。
  1. 每个洗脱液（从SEC）将200μl（等于最大100μg蛋白质）转移到新鲜的1.7 ml管中。将其余洗脱液储存在-20°C。
  2. 加入20μl10％SDS，并在Thermomixer中在95℃下煮沸8分钟。冷静到RT。
  3. 离心管在室温下以10,000 x g进行1分钟，从管的盖子收集蒸发的液体。
3. 下拉
  注意：Bio-EP标记的亚基在本步骤中使用链霉亲和素珠。
  1. 将样品转移到带有预洗珠（来自C1）的15ml Falcon管中，并用50mM HEPES（pH 7.4）填充至10ml。
    注意：SDS可能会干扰下拉。因此，SDS在此步骤中稀释至0.02％。
  2. 在4℃孵育2小时。在孵育期间旋转管子（应用20 rpm）。
  3. 离心管以2,000 x g离心2分钟（4℃）。丢弃上清液。
  4. 将小珠重新悬浮在2×500μlPBS中并将浆液转移到1.7ml管中
  5. 离心管以2,000 x g离心2分钟（4℃）。丢弃上清液。
  6. 用500μlPBS洗涤珠子两次。以2,000 x g离心2分钟（4°C）。
  7. 重新悬浮在60μl1x Laemmli缓冲液中，并在90℃下在Thermomixer中煮沸15分钟。
    注意：结合珠子的Bio-EP标记亚基在该步骤中被洗脱。
  8. 离心管以2,000 x g离心2分钟（4℃）。使用注射器将上清液转移到新鲜的1.7ml管中
  9. 将样品储存在-20°C。
蛋白质印迹检测
注意：可以执行替代的检测模式或进一步的处理步骤。该方案体现了免疫球蛋白β5i和标准蛋白酶体亚单位β5的检测。
1. 将蛋白质在250mA下将蛋白质印迹在聚偏二氟乙烯膜上90分钟注意：在进行电泳前，将膜浸入MeOH中。
2. 在1×Roti ^{®阻塞溶液中，在室温下封闭膜60分钟。}
3. 孵育膜与：
  一个。 1：2,000抗-β5i（Roti ^{-Block）过夜/周末在4℃;
  b。 1：1,000抗β5（Roti ^{-Block）过夜/周末4℃。}}
4. 在塑料盒中用PBST洗涤膜三次，持续10分钟。
5. 用1：40,000抗兔HRP偶联二抗（新英格兰Biolabs，PBST稀释）孵育60分钟。
6. 在室温下用PBST将膜3×洗涤10分钟。
7. 用新鲜制备的ECL底物覆盖膜。
8. 将膜放在塑料箔中，并在暗室中用X射线胶片覆盖。几分钟后开发电影。
  
  图2.基于工作流程活动的下拉。活性催化标准（棕色）和免疫蛋白酶体（黄色）亚单位用ABP Bio-EP共价标记。通过SEC去除未结合的ABP后，将蛋白酶体的复合结构溶解在1％SDS中。进行用链霉抗生物素蛋白包被的琼脂糖珠的下拉以捕获ABP标记的亚单位。在PBS洗涤的三个连续步骤中除去未标记的蛋白质，结合的亚基通过1x Laemmli中的加热洗脱。

数据分析

图3.使用Bio-EP的基于活性的下拉蛋白的Western印迹。 Western印迹显示ONX-0914处理的MH-S细胞裂解物中活性β5i和β5的量，并代表三次独立实验。随着β5i特异性抑制剂浓度的增加，下拉洗脱液中检测到的β5i的量减少，而β5仍然不受ONX-0914处理的影响。

食谱

MH-S细胞的完整生长培养基
500 ml RPMI-1640
10％胎牛血清（FBS）
50μMβ-巯基乙醇
100 U/ml青霉素 - 链霉素
TSDG缓冲液（10ml）
1ml 100mM Tris储备液（pH7.5）
1.1ml 10mM MgCl 2 库存
100μl1 M NaCl储备液 20μl50 mM EDTA储备液 100μl100mM NaN 3 库存
10μl1 M DTT库存
100μl200 mM ATP储备液 1.15毫升87％甘油
用超纯水加满10毫升最终浓度：10mM Tris/HCl，1.1mM MgCl 2，10mM NaCl，0.1mM EDTA，1mM NaN 3，1mM DTT，2mM ATP，10 ％（v/v）甘油
调节pH至7.0
等分并储存于-20°C
在使用前立即加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）（1 ml用于50ml裂解缓冲液;或者，25x原料可以在超纯水中制备，根据需要新鲜加入，储存于-20°C）
500μMBio-EP在DMSO中
1mg Bio-EP（MW = 724.95）
2.759ml DMSO
等分试样（建议30-50μl），并储存于-20°C
50mM HEPES（pH 7.4; 1L）
11.915 g HEPES
用超纯水加满1升根据需要用HCl或NaOH调节pH至7.4
10％SDS（10ml）
1克SDS
用超纯水加满10毫升在通风橱下准备，佩戴适当的呼吸保护
6x Laemmli缓冲液（10ml）
3ml 1M Tris HCl（pH6.8）
1.5毫升甘油
0.6克SDS
0.5 g DTT
1毫克溴酚蓝
用超纯水加满10毫升过滤器（0.2μm）
等分并储存于-20°C
4x SDS-PAGE拆分缓冲液（pH8.8）
36.4克Tris
用超纯水加满150毫升用37％HCl调节pH至8.8
用超纯水加满200毫升过滤器（0.2μm）
0.48克SDS
存储：RT
4x SDS-PAGE堆叠缓冲液（pH 6.8）
6.05克Tris
用超纯水加满40毫升用37％的HCl将pH调节至6.8
用超纯水加满100毫升过滤器（0.2μm）
0.4克SDS
存储：RT
堆叠凝胶（4 ml）
1 ml 4x堆叠缓冲液
480μl30％丙烯酰胺
2.52ml超纯H 2 O
50μl10％APS
12μlTEMED
溶解凝胶（15％丙烯酰胺）（8 ml）
2 ml 4x分辨率缓冲液
4ml 30％丙烯酰胺
2ml超纯H 2 O
100μl10％APS
12μlTEMED
PBST（0.1％吐温）（1升）
999 ml 1x PBS
1ml吐温20

致谢

该方案用于以前在细胞死亡和分化中发表的工作（Chen等人，2016）。这项工作得到了亥姆霍兹中兴慕尼黑的校内资金的支持。作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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