材料和试剂

24孔板
2 ml Eppendorf管
在C57BL/6小鼠中由3-甲基胆蒽诱导MCA205纤维肉瘤细胞（H2 ^b）（Shu等人，1985）。这里描述的测定适用于其他细胞系
DMEM高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11965092或GE Healthcare，HyClone ^{TM，目录号：SH30022）}}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：16000044）}
100mM丙酮酸钠溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11360070）}
HEPES，1M缓冲溶液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15630080）}
青霉素和链霉素
米托蒽醌（Sigma-Aldrich，目录号：M6545）
胰蛋白酶（0.25％）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15050065）}
1×PBS，pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010031）}
DiOC6（3）（3,3'-二己氧基亚硫氰酸碘化物）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：D273）}
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：D1306）}
CALR抗体（Ab）：兔单克隆Ab，克隆号：EPR3924（Abgent，目录号：AJ1124a;或Abcam，目录号：ab92516）;或兔多克隆Ab（Abcam，目录号：ab2907）
Alexa488缀合的山羊抗兔IgG（H + L）二抗（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11008）
ATP生物发光测定试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：FL-AA）或ENLITEN ATP测定系统（Promega，目录号：FF2000）
Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（BD，目录号：559763）
HMGB1 ELISA试剂盒（Tecan Trading，目录号：ST51011）
1x Annexin V结合缓冲液（见配方）
ATP测定组合（参见食谱）
rLuciferase/Luciferin缓冲液（参见食谱）

设备

离心机
水包覆的CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，superson TM，型号：HERAcell ^150i）
多通道移液器
SpectraMax L酶标仪（Molecular Device，型号：SpectraMax L）
SpectraMax i3多模式检测平台（分子装置，型号：SpectraMax i3）
Attune ^TM NxT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific，型号：Attune ^TM NxT Flow Cytometer）

注意：或者，VICTOR X multilabel阅读器（PerkinElmer）和MACSQuant ^{/em>分析仪10（Miltenyi Biotec）也是合适的。}

软件

Excel（Microsoft Office）
GraphPad Prism（美国加利福尼亚州圣地亚哥）
FlowJo软件（Treestar Inc.，Ashland，OR，USA）

程序

将MCA205肿瘤细胞在补充有10％FBS，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES和100U/ml青霉素和链霉素的DMEM中培养。将细胞接种在每孔500μl培养基的24孔板（5×10 4个细胞）中。第二天，用500μl预热的新鲜培养基（含或不含化疗药物）仔细替换培养基。培养基可根据不同细胞系的要求进行取代。米托蒽醌的推荐剂量为1-10μM。

检测细胞死亡
1. 在所需时间点，通过移液管彻底收集上清液。贴壁细胞被分离并用胰蛋白酶分散。然后收集所有细胞以与原始上清液组合。
2. 通过在300×g，10分钟，4℃下旋转将细胞收集在2ml Eppendorf管中，并弃去上清液。去除上清液时请勿打扰细胞沉淀
3. 将细胞沉淀重新悬浮于含有1μMDiOC6（3）的PBS中，37℃孵育15分钟。将染色的细胞用PBS洗涤两次（10倍初始体积），然后重悬于含有1μg/ml DAPI的400μlPBS中。样品准备好在30分钟内进行细胞荧光分析（图1）
4. 或者，用PBS洗涤细胞沉淀两次并重悬于含有PE-膜联蛋白V（1:50稀释）和DAPI（1μg/ml）的100μl1x Annexin V结合缓冲液中。细胞浓度不应超过1×10 6细胞/ml。在黑暗中室温孵育15分钟后，在每个管中加入400μl1x Annexin V结合缓冲液。样品准备在30分钟内进行细胞荧光测定分析（图2）
  
  图1.用PBS对照（左）或1μM米托蒽醌预处理的MCA205肿瘤细胞的DiOC6（3）-DAPI双染色的典型点图，28小时（右）
  
  图2.具有用PBS对照（左）或1μM米托蒽醌预处理的MCA205肿瘤细胞的膜联蛋白V PE-DAPI双染色的典型点图，24小时（右）
钙网蛋白（CALR）暴露的检测
1. 对于每个样品，收集上清液和细胞的整个孔并在所需时间点（例如6小时，16小时，24小时和48小时）在相同的Eppendorf管中合并。以300×g旋转后弃去上清液，4℃10分钟
2. 使用抗CALR兔单克隆抗体（1:500稀释，Abgent，克隆EPR3924）或兔多克隆CALR Ab（稀释1:100，Abcam）在黑暗中在冰上对30分钟染色肿瘤细胞。
3. 用PBS洗涤（初始体积的10倍）后，在冰上用Alexa488缀合的山羊抗大鼠IgG（H + L）二抗（1:500稀释）将肿瘤细胞染色30分钟。
4. 用PBS洗涤（10倍初始体积）后，肿瘤细胞用DAPI以1μg/ml进一步染色，室温5分钟。将所有样品保存在冰上，并在30分钟内通过细胞荧光测定法进行分析。为了在活细胞中计算CALR ⁺细胞，从门控中排除DAPI ⁺细胞（图3）。
  
  图3.使用PBS对照（左）或1μM米托蒽醌预处理的MCA205肿瘤细胞的CALR-DAPI双染色的典型点图，24小时（右）
检测ATP释放
1. 在期望的时间点收集300微升（300μl）上清液，并在5℃下以5℃旋转5分钟以除去细胞或碎屑。
2. 收集的上清液应立即进行ATP生物发光测定或储存于-80℃（每等分试样150μl）。上清液在室温或反复冻融过程中的存储导致ATP降解迅速。解冻后，无需再次上清样品。
3. 对于ATP生物发光测定试剂盒（Sigma-Aldrich），推荐使用ATP Assay Mix稀释缓冲液进行25倍稀释的ATP Assay Mix储备溶液。将样品或标准品（每孔100μl）快速加入含有稀释的测定混合物（100μl/孔）的板中。
4. 对于ENLITEN ^® ATP测定系统（Promega），将样品和标准品（20μl/孔）加入到冰上的板中。然后将重组的rLuciferase /萤光素试剂（100μl/孔）快速加入每个孔中，多孔移液管。
5. 用发光酶标仪记录ATP驱动的化学发光信号。使用10倍连续稀释度的标准曲线（范围从10℃至10℃至10℃-12℃）计算样品中的ATP浓度（图4）。
  注意：样品与试剂盒混合后，应立即扫描微孔板。
  
  图4.计算ATP内容的典型标准曲线
检测HMGB1释放
1. 在期望的时间点收集300微升（300μl）上清液，并在5℃下以5℃旋转5分钟以除去细胞或碎屑。
2. 将上清液新鲜施用于基于ELISA的定量，或储存在-80℃（每等分试样150μl）。应避免重复冻结/解冻样品。 HMGB1的浓度是按照用户使用的标准测试程序进行的。
3. 样品和标准品在37℃下孵育20-24小时是必要的，以达到最大的灵敏度。高灵敏度检测程序可用于检测样品中的低HMGB1含量
4. 光密度用450nm和600nm的光度计测量（用作参考，从450nm读数中减去）。 HMGB1的浓度根据标准曲线计算（图5）
  
  图5.计算HMGB1内容的典型标准曲线

数据分析

流式细胞术数据可以通过flowjo软件（Treestar Inc.，Ashland，OR，USA）进行分析。细胞凋亡细胞是DAPI（DiC）（3）^low或DAPI Annexin V ⁺。坏死细胞是DAPI ⁺ DiOC6（3）^low或DAPI ⁺ Annexin V ⁺。数据应以平均值±SD（或SEM）计算并显示。具有CALR暴露的细胞是CALR ⁺ DAPI ^-。 ATP和HMGB1的浓度根据标准曲线计算。建议所有实验应至少2-3次独立进行。统计和数据可视化由Graphpad Prism软件（San Diego，CA，USA）生成。不配对的双尾学生的测试是首选方法。

笔记

为了比较药物的细胞毒性或不同细胞的易感性，可以在不同的时间点或针对不同剂量的药物检查细胞死亡。
为了准确检测上清液中的ATP，所有操作都应尽快在冰上进行
可以从冷冻上清液中检测出ATP，这些蛋白质应优先储存在-80°C。但是，在收集上清液时应特别注意。上清液中的细胞污染会由于细胞在冻融后破裂而产生极高的ATP含量。移液管的尖端不能到达培养板的底部。防止介质干扰，并轻轻收集上清液。
膜联蛋白V-PE比Annexin V-FITC试剂盒更灵敏和可靠，以检测细胞死亡。

食谱

1x Annexin V结合缓冲液
稀释10倍膜联蛋白V结合缓冲液提供的Annexin V细胞凋亡检测试剂盒与ddH 2 O
ATP测定混合物
对于ATP生物发光测定试剂盒，ATP测定混合物和ATP测定混合物稀释缓冲液分别用5ml和50ml ddH 2 O在冰上溶解30分钟。用25倍稀释缓冲液稀释ATP测定混合物储备溶液。
荧光素酶/萤光素缓冲液
对于ENLITEN ^® ATP测定系统，使用试剂盒中提供的12ml重组缓冲液重构rLuciferase/Luciferin。

致谢

马玉泰博士获得中国医学科学院中国千年青年人才计划资助（授权号：2015RC310003）和江苏省自然科学基金资助（批准号：BK20160379）。

参考文献

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