材料和试剂

Pirex ^®培养管25 x 150 mm
一次性注射器（25 ml）
1.5 ml Eppendorf管
柑橘种子（例如，从商业砧木）
Murashige和Skoog（MS）培养基（4,302.09mg L ^{-1）（Duchefa Biochemie，目录号：M0221）}
蔗糖（30g L ^-1）（任何供应商）
无菌MiliQ水
琼脂（欧洲细菌琼脂）（Conda，Pronadisa，目录号：1800）
（0.1％v/v）（Sigma-Aldrich，目录号：P2287）
肌醇（100mg L ^{-1）（Duchefa Biochemie，目录号：I0609）}
吡哆醇-HCl（1.0mg L -1）（Duchefa Biochemie，目录号：P0612）
硫胺素-HCl（0.2mg L -1）（Duchefa Biochemie，目录号：T0614）
烟酸（0.5mg L ^{-1）（PANREACQUÍMICA，目录号：A0963）}
甘氨酸（0.2mg L ^{-1）（PANREACQUÍMICA，目录号：141340）}
混合A（见配方）
次氯酸钠溶液（50.0％，v/v）（参见食谱）
NaOH（0.1 N）（任何供应商）（见配方）

设备

Pirex ^®介质溶液瓶
高压灭菌器（Raypa，型号：蒸汽灭菌器AES-75）
层流罩（Bioquell，ASTEC MICROFLOW，型号：Microflow Laminar Flow Workstation M50546）
钩镊子
生长室（Snijders Scientific，型号：经济Lux气候室）
长柄剪刀带曲线尖端
pH计（HACH LANGE西班牙，型号：pH计Basic 20）

程序

准备生长培养基
1. 溶解4.3g L ^{的MS，1.0ml混合物A（参见食谱）和30g L -1的蔗糖在蒸馏水中。}
2. 用NaOH（0.1N）将溶液的pH调节至5.7±0.1
3. 将溶液分配到瓶中进行高压灭菌。
4. 将溶液在105°C下高压灭菌5分钟
5. 溶解9.0 g L ^{琼脂琼脂固化培养基。}
6. 即使使用温热的介质和注射器，也可以将25ml溶液分配到培养管中并覆盖。
7. 在115°C将含有管的机架高压灭菌15分钟。
8. 让它冷却并在室温下储存。
植物材料制备
1. 去除种子的外套以增加和均质种子发芽。避免损害种子;特别注意不要伤害胚胎（图1）。将其放入次氯酸钠溶液（50.0％，v/v）加0.1％（v/v）Tween 20分钟内灭菌10分钟。
2. 用无菌蒸馏水冲洗种子三次，以除去次氯酸盐溶液
3. 将种子存放在无菌层流罩中，防止脱水。
  
  图1.用于提高发芽率和均质化的种子包衣移除实例
萌发和生长条件
1. 在无菌层流罩中并通过无菌镊子进行处理，将每根管子放入固化的生长培养基中并在播种后覆盖管（图2A）。
2. 一旦将种子播种到生长室中，持续两周保持在25℃和黑暗以促进发芽（图2B）。
3. 两周后，将发芽的幼苗（当时大约5厘米）转移到发光的生长室。将光周期条件设定为16:8小时（亮：暗），温度为25℃，最小辐射为150μmol/平方米以上光合作用辐射（ PAR）（图2C）。
4. 在光照条件下三周后植物生长并变成绿色，需要去除枝条。在无菌层流罩中，植物通过长柄剪刀脱离枝条（图3）。在层流罩的无菌条件下进行。通过在根/芽结合处下方约5毫米处切割出芽，将剩余的根保留在培养基中，以避免未来的芽再生（图2D）。
5. 包含根组织的管在进行实验之前保持至少两天以排除伤口的任何副作用（图4）。
  
  图2.在体外条件下的幼苗发育实例 A.播种种子。 B.黑暗条件下生长的Etiolated幼苗。 C.照明3周后种子变绿。 D.去除芽/根结点下的枝条后，绿根的细节。
  
  图3.用于分离根的长柄剪刀的细节
  
  图4.响应暗（右）和轻（左）曝光分离根的着色细节

数据分析

该方案的目的是提高根中类胡萝卜素的含量。为了评估这些颜料的提高，可以使用两种替代方法：一方面，可以通过许多不同的方案进行分光光度分析，在这种情况下评估总胡萝卜素含量（，Wellburn，1994 ）。或者，详细的类胡萝卜素组合物可以通过与二氧化硅阵列检测器（HPLC-DAD）相结合的液相色谱来实现，如Manzi等人（2016）所详述。应根据所使用的方法对类胡萝卜素进行定量。

笔记

柑橘基因型的增长率可能不同。为了避免不必要的对新陈代谢的影响，避免根部过度生长，这可能导致早期衰老。为此，您可以相应地调整植物生长时间（，即，在光线条件下减少3周的时间）。
为了获得高水平的样品材料，良好的选择是增加个体根的数量，而不是延长根系生长期。考虑到20个根提供约1.5-2.0g的新鲜组织。

食谱

混合A
稀释肌醇（100mg/L），吡哆醇-HCl（1.0mg L -1），硫胺-HCl（0.2mg L -1） -1 ），烟酸（0.5mg L ^{-1）和甘氨酸（0.2mg L -1）在蒸馏水中的溶液
在1.5ml Eppendorf管中分批等分试样必须储存于-20°C 注意：为每1.5升生长培养基添加其中一种Eppendorf（1.5毫升），}
次氯酸钠溶液（50.0％，v/v）
混合等份的纯次氯酸钠（100％）和蒸馏的MiliQ水向最终溶液中加入20％0.1％（v/v）的润湿剂
该解决方案可以存储或准备在
的那一刻注意：准备的溶液体积取决于要消毒的种子数量。为了避免次氯酸盐的任何有害影响，种子不能暴露于消毒剂溶液超过10分钟。
NaOH（0.1N）
将40g NaOH溶解在1.0L蒸馏水中，制成1.0N的溶液此解决方案必须存储在4°C
在制备0.1N溶液时，取1.0毫升1.0N NaOH溶液，加入9.0毫升蒸馏水，完成10ml。注意：滴加0.1N NaOH滴加萌发培养基的pH值。通常，只有几滴足以达到1.0L培养基
的pH = 5.7±0.1

致谢

这项工作由经济大臣（MINECO）和Jaume I大学分别通过拨款号AGL2013- 42038-R和P1IB2013-23支持。 MM由Generalitat Valenciana（西班牙）接受了"Santiago Grisolia"奖学金。该协议基于Manzi等人的手稿中使用的方法。（2016）。

参考文献

Arbona，V.，Manzi，M.，Ollas，C.and Gomez-Cadenas，A.（2013）。代谢组学作为调查植物中非生物胁迫耐受的工具。 Int J Mol Sci 14（3）：4885-4911 。
Cao，H.，Wang，J.，Dong，X.，Han，Y.，Ma，Q.，Ding，Y.，Zhao，F.，Zhang，J.，Chen，H.，Xu， Xu，J. and Deng，X.（2015）。类胡萝卜素积累影响柑橘中的氧化还原状态，淀粉代谢和类黄酮/花青素积累。 BMC Plant Biol 15：27.
Lado，J.，Rodrigo，MJ，López-Climent，M.，Gómez-Cadenas，A.andZacarías，L。（2016）。抗氧化系统对葡萄柚红皮中寒冷耐受性的影响 Postharvest Biol Tec 111 ：214-223。
Manzi，M.，Lado，J.，Rodrigo，MJ，Arbona，V.and Gomez-Cadenas，A.（2016）。水分胁迫柑橘根中的ABA积累不依赖于该器官中的类胡萝卜素含量。植物科学 252： 151-161。
Wellburn，AR（1994）。叶绿素的光谱测定a和b，以及总类胡萝卜素，使用不同分辨率的分光光度计的各种溶剂。植物生理学144：307-313。