材料和试剂

锥形管（50ml）（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
Parafilm M实验室电影（Hach，目录号：251764）
具有透明盖的塑料培养皿（JET BIOFIL细胞和组织培养板6孔）
提示
Miracloth（EMD Millipore，目录号码：475855）
标签胶带（三叶草，目录号：ST-12-20）
纸巾
加利福尼亚加拿大：哥伦比亚（Col-0）
乙醇> 99.8％（Sigma-Aldrich，目录号：02860）
注意：本产品已停产。
乳酸85％（w：w）（Sigma-Aldrich，目录号：L1250，DL-乳酸11.3M）
苯酚（TE缓冲液平衡，pH 7.5-8.0）（Roti - 苯酚，Carl Roth，目录号：0038.1）
甘油≥99％（Sigma-Aldrich，目录号：G7757）
无菌蒸馏水（EMD Millipore，milli-q a10水净化系统）
台盼蓝（Sigma-Aldrich，目录号：T6146）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（BD，Difco ^{TM，目录号：213400）}
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）（BD，Difco ^{TM，目录号：254920）}
次氯酸钠溶液（Sigma-Aldrich，目录号：239305）
十二烷基硫酸钠（SDS）98％（Sigma-Aldrich，目录号：862010）
注意：本产品已停产。
吐温20洗涤剂（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
台盼蓝染色溶液（见配方）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（见食谱）
（B.c ）接种物（见配方）
马铃薯葡萄糖汤（PDB）（见食谱）
种子灭菌方案（见食谱）

设备

微型剪刀NOYE（Auxilab，目录号：62101111）
解剖镊子，无齿125毫米（Auxilab，目录号：61302012）
生长室（VötschIndustrietechnik，型号：HERAEUS VB1514）
生物安全柜（无菌，型号：BBF-2SSCH）
来自Rainin Instruments的Micropipets P1000，P200和P20
重量分析440（KERN& SOHN）
耦合到CCD相机（Leica Microsystems，型号：DC 280）的立体显微镜（Leica Microsystems，型号：MZ9）
电导率计（HACHLANGE SPAIN，CRISON，型号：BASIC30）
高压釜（JP SELECTA，型号：MED 20，目录号：4001757）

软件

ImageJ软件（Rasband，WS，ImageJ，美国国立卫生研究院，Bethesda，马里兰州，美国， http://imagej.nih.gov/ij/，1997-2016）
Statgraphics Centurion XVI.II软件（StatPoint Technologies，Inc. www.statgraphics.com ）

程序

生长拟南芥植物
1. 用种子灭菌溶液杀灭拟南芥种子（见食谱）20分钟，然后用无菌水洗涤四次。
2. 在黑暗中将种子在4°C室中分层2天。
3. 在生长室中以3：1（土壤：蛭石）的混合物种植种子，在10小时光/14小时黑暗光周期下持续21天，在22℃和60％湿度下光强度为120勒克斯。 />
与灰葡萄孢接种
1. 将高压釜中的所有材料在120℃下灭菌20分钟
2. 将植物放入生物安全柜中，每次一次接种一滴5μl的B.c真菌接种物（见食谱，图1A）。
3. 用Parafilm覆盖植物（图1B），以避免分生孢子的分散，并保持高湿度（90-100％）以获得真菌的最佳生长。将它们返回到生长室，并在黄色末端的Parafilm（> 10）中形成小孔，以避免乙烯在托盘内积聚，这将激活植物防御反应并停止真菌生长。
4. 在25℃，10小时光照条件下，在生长室中孵育 C.c 接种植物，直到取样日期，通常在接种后2至7天（图1C）。
5. 在实验的每个时间点，用剪刀收获接种的叶子，并将其直接放入含有5ml新鲜的台盼蓝溶液的平板（参见食谱，图1D）。此时应确保叶子完全浸入液体中;如有需要，请使用蓝色的烙铁头将其淹没。盖板，等待至少30分钟。然后在死组织的位置看到蓝色。总染色时间不应超过1小时。避免使用沸腾方法，真空渗透方法或微波处理，这将阻碍以后的脱色过程。
  注意：取样的时间可能会根据拟南芥/加入/突变体/线-Bc相互作用和真菌毒力而改变。
6. 取出锥虫溶液，立即用98-100％乙醇重新填充板。用Parafilm密封板，以避免可能会破坏叶子或将其固定在塑料板上的干燥。将组织置于乙醇溶液中至少过夜，然后使用5ml移液管;用新鲜的乙醇代替乙醇溶液，重复，直到绿色组织变得完全无色（图1E）。取出乙醇并用60％甘油溶液覆盖叶子。此时，叶片准备转移到玻璃表面，用显微镜可视化（图1F）。
7. 如果需要，可以使用根据Govrin和Levine（2000）*的电导率的离子泄漏损失验证细胞死亡测量，或者使用ImageJ软件测量叶死亡面积（Rasband，WS，ImageJ，美国国立卫生研究院，Bethesda，Maryland，美国， http://imagej.nih.gov/ij/， 1997-2016）注意：为了测量离子泄漏，我们遵循Govrin和Levine的方案（2000）。我们每个生物重复使用5个接种或对照叶，每个基因型有4个重复。将叶子在室温下浸入水中3小时，然后按照制造商的说明书测量电导率。在-80℃下保持o/n的相同样品获得了离子泄漏总量（100％）。数据分析如下所示进行。
  
  图1.用拟南芥进行拟南芥叶片接种的程序 .A和B.将拟南芥线条的叶表面接种用10μl真菌（10μg/ml）将植物转移到具有透明盖子的塑料托盘中以允许真菌生长。 C.进行感染进展，直到观察到植物症状。 D.在板上收获叶子，并用台盼蓝染色溶液吸收不超过1小时。 E.将叶子浸入乙醇中过夜，直到它们变得透明。 F.将叶转移至60％甘油进行显微镜检查。
  
  图2.拟南芥具有不同程度的感染。 A-F。切割叶子后立即拍摄照片，种植在土壤上的植物。 G-L。用台盼蓝染色的代表性叶片的照片，表现出类似于上述叶片的感染水平。 Bar = 0.5cm。

数据分析

对于所有实验，每个生态型至少10个叶被取样染色。实验重复至少四次。必要时，使用ImageJ（Particle Analysis，Surface Plot，and Measure Tools）软件，按照ImageJ的用户指南 https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf ）。叶离子泄漏数据用Statgraphics Centurion XVI.II软件（StatPoint Technologies，Inc. www.statgraphics.com ）。进行单因素方差分析（ANOVA）测试，计算平均值和标准误差以及Duncan的置信水平为0.05％的平均值。

食谱

台盼蓝染色液
10ml乳酸（85％w：w）
10毫升苯酚（TE缓冲液平衡，pH 7.5-8.0） 10ml甘油（≥99％）
10ml蒸馏水
40毫克台盼蓝（终浓度10毫克/毫升）
注意：将溶液在室温下储存在通风罩中，并始终使用新鲜的溶液。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
4 g/L PDA在蒸馏水中
（B.c ）接种物*
将Botrytis菌株在28℃下在PDA培养基平板（马铃薯葡萄糖琼脂，Difco，Detroit，MI，USA）上生长8天，将孢子收集在无菌水中并储存在20℃ ％甘油在-80°C直到使用。
注意：真菌的存量应保存在-80℃的20％甘油中，以避免由于真菌重复生长而引起的毒力损失。真菌的最终浓度将取决于真菌分离物的毒力通常在105-107孢子/ml之间。使用血细胞计数器（ http：//www.hemocytometer）测量真菌浓度（每ml的分生孢子）。 org/）。当Bc分离株具有低毒力，或者当需要高水平或快速真菌生长时，可以使用可能的PDB的最大稀释度在马铃薯葡萄糖肉汤培养基（PDB）存在下进行接种，将相同浓度的PDB加入到对照接种叶。
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）
4 g/L PDB在蒸馏水中
种子灭菌解决方案
次氯酸盐溶液（30％，v：v）
十二烷基硫酸钠（0.1％，v：v）

致谢

该协议由Keogh和合作者（1980）进行了修改。我们承认CGBP的Wilkinson先生的贡献。导致这些结果的研究从第AL13-P（I + D）-05号，第AL14-PID-26号至DomínguezJA号和Berrocal-Lobo M号，从RTA2013-00027-00-00至Castellano M M和Berrocal-Lobo M.

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Govrin，E.M和Levine，A。（2000）。过敏反应促进了坏死性病原体灰霉病菌的植物感染。 10卷（13）：751-757。
Keogh，RC，Deverall，BJ和Mcleod，S。（1980）。比较抗性和易感大豆中Phakopsora pachyrhizi的组织学和生理学反应。英国真菌学学会交易会（74）（2）：329-333
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