材料和试剂

6孔板（适合您的细胞的表面，例如，，SARSTEDT，目录号：83.3920）
微量离心管（例如，VWR，目录号：89202.684）
比色皿（例如， SARSTEDT，型号：67.742）
印迹膜和Whatman纸（例如，Trans-Blot Turbo Transfer Pack Mini包含0.2μm硝酸纤维素和转移缓冲液，Bio-Rad Laboratories，目录号：170-4158）
表达半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10的人细胞，这里：稳定过表达CD95的HeLa细胞（Neumann等人，2010; DKMZ，目录号：ACC 57）
适用于您的细胞的培养基（例如，包含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM / Ham's F12）
CD95L已经按照Fricker等人，2010所述进行了制备
牛血清白蛋白（BSA）标准2mg / ml（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000260）
SDS-poly丙烯酰胺凝胶（例如，Mini-PROTEAN TGX无染色预制凝胶，12％，Bio-Rad Laboratories，目录号：456-8046）
蛋白测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0006）
蛋白质标准品（例如，精密加蛋白全蓝标准品，Bio-Rad Laboratories，目录号：1610373）
抗半胱氨酸蛋白酶-8抗体，克隆C15（终浓度为0.5-2微克/毫升，一种亲切的礼物P.Krammer，DKFZ海德堡）
抗半胱天冬酶-10抗体，克隆4C1（稀释度1：1,000，终浓度1μg/ ml，MEDICAL＆amp; BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：MBL-M059-3）
抗肌动蛋白抗体（稀释度：1:4,000，终浓度0.125-0.2μg/ ml，Sigma-Aldrich，目录号：A2103）
HRP偶联同种型特异性第二抗体（例如，Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-2060，sc-2004，sc-2062）
用于增强发光的HRP-底物（例如，Luminata Forte Western HRP底物，EMD Millipore，目录号：WBLUF0500）
10倍PBS（Biochrom，目录号：L1835）
cOmplete ^{TM蛋白酶抑制剂混合物（PIC）（Roche Diagnostics，目录号：11 836 145 001）}
Tris（AppliChem，目录号：A2264）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：P029.3）
EDTA（Carl Roth，目录号：CN06.2）
甘油（Carl Roth，目录号：3783.1）
Triton（Carl Roth，目录号：3051.4）
Tween-20（AppliChem，目录号：A1389）
奶粉（Carl Roth，目录号：T145.5）
叠氮化钠（Carl Roth，目录号：K305.1）
β-巯基乙醇（Carl Roth，目录号：4227.2）。
10×Tris / Glycine / SDS（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0723）
4x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0747）
1x PBS（参见食谱）
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC，参见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
1×Tris / Glycine / SDS（参见食谱）
PBS-T（参见食谱）
阻塞缓冲区（见配方）
初次抗体稀释（参见食谱）
4x Laemmli样品缓冲液（减少，见配方）

设备

CO 2，例如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，型号：BBD 6220）的培养基（例如，
细胞刮刀（例如，，Orange Scientific，目录号：4460600N）
离心机（Eppendorf，型号：5418R）
光度计（Bio-Rad Laboratories，型号：SmartSpec Plus分光光度计）
电泳室和电源（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra电池和PowerPac HC）
转运系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot Turbo Transfer System）
成像仪（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc XRS +成像系统）

软件

图像实验室（Bio-Rad Laboratories）

程序

细胞裂解
1. 在2ml培养基中的6孔的孔中每孔2.5×10 5 HeLa细胞（参见材料和试剂6），并在37℃，5％CO 2 / sub>。
2. 第二天对照细胞，吸出培养基并用新鲜培养基代替。以时间依赖性方式（这里：20,40,60,90,120分钟）刺激具有凋亡诱导剂（这里为250ng / ml CD95L）的细胞。刺激剂量和时间是细胞系依赖性的，必须对每个细胞系进行测试。刺激应以一个6孔板可以一次收获的方式进行。
3. 在37℃，5％CO 2孵育细胞。
4. 向细胞中加入冷的PBS（不要吸入培养基），通过刮擦并将包含细胞的培养基转移到新管（冰上的一切）中收获它们。小心将所有细胞转移到新管中。
5. 在4℃，500×g离心5分钟。
6. 丢弃上清液，而不是细胞沉淀！
7. 加入1 ml冷PBS。
8. 在4℃，500×g离心5分钟。
9. 吸出并弃去上清液。
10. 将沉淀物保存在-20°C或通过将细胞沉淀物直接重悬在30μl冰冷的裂解缓冲液中（见方案3），继续细胞裂解，注意将其完全重新悬浮。
11. 在冰上孵育30分钟，旋转2-3次。
12. 在4℃，16,400×g离心15分钟。
13. 将上清液（=裂解物）转移到新管中，弃去细胞沉淀。上清液应具有清晰，淡黄色的颜色
测量的蛋白质浓度
1. 通过在比色皿中混合2μl裂解物和1,000μlBio-Rad测定染料试剂（参见方案4）来测量蛋白质浓度。
2. 根据制造商的说明准备BSA标准稀释液。
3. 混合2μl裂解缓冲液与1,000μlBio-Rad溶液，并将其用作空白。
4. 在室温下孵育5分钟。空白应为棕红色，而含裂解物的样品应变成蓝色。
5. 用Bio-Rad SmartSpec plus或其他分光光度计测量595 nm样品的蛋白质浓度和BSA标准品。按照分光光度计的指示进行蛋白质标准。注意在线性范围内测量，并以高蛋白浓度稀释样品。预期蛋白质浓度在3至5 mg / ml之间。
SDS-PAGE和印迹转移
1. 使用裂解缓冲液和4x Laemmli样品缓冲液（还原，见方法9）准备25μg蛋白质裂解物至终体积为15μl（例如，将5μl5μg/μl裂解物与6.25 μl裂解缓冲液和3.75μl样品缓冲液）。如果蛋白质浓度太低，您可以使用更高负荷量的凝胶或将蛋白质量减少至20μg。
2. 将样品在95℃加热5分钟。
3. 短时间旋转以避免盖上的蒸汽。
4. 用凝胶和1×Tris / Glycine / SDS（十二烷基硫酸钠）缓冲液制备室（参见方案5）。
5. 在12％Bio-Rad预浸渍无色凝胶上载样。小心将完整的样品装入井中，不会泄漏并溢出。使用25μlHamilton注射器或长移液管吸头可以使凝胶更容易上胶。将尖端或注射器的末端放在井的底部，并非常缓慢地将样品推入井中。然后小心地从孔中取出Hamilton注射器或尖端，而不会溢出样品。当使用汉密尔顿注射器时，将三次加载下一个样品。
6. 加载2μl所有蓝色蛋白质标准品。
7. 用150 V运行凝胶，直到蛋白质染料通过凝胶底部。检查不时的进度。
8. 将凝胶置于Tris / Glycine / SDS缓冲液中。
9. 如果使用Bio-Rad无染色凝胶，用一分钟的紫外线激活凝胶中的染料，拍摄凝胶图像并检查蛋白质的分离。不需要使用Bio-Rad无染色凝胶体系。该系统基于在紫外光下与色氨酸反应产生荧光的化合物的实施。印迹后荧光团在膜上是可见的。
10. 在转移缓冲液存在下准备由Whatman纸片，膜（PVDF或硝化纤维素）=印迹，凝胶和Whatman纸张组成的三明治。小心将三明治置于面向阴极的印迹系统中，使蛋白质从凝胶转移到膜上，而不是进入Whatman论文。按照2.5 A，25 V，9分钟的说明，用Transblot Turbo传输系统打印。也可以使用不同的系统进行蛋白质印迹。
11. 用PBS-T（PBS-Tween，见方案6）冲洗印迹短时间。
12. 如果您使用Bio-Rad无染色凝胶，请拍摄印迹，并检查吸气结果是否有气泡和相等的转移。
半胱天冬酶-10的膜阻断和检测
1. 在封闭缓冲液（见方案7）中孵育1小时，室温振荡。印迹应完全用缓冲液覆盖。
2. 用PBS-T冲洗3×5分钟，将溢出缓冲液冲洗至培养皿中，不直接冲洗到印迹上，以避免蛋白质的去除。
3. 孵育与一次抗体稀释（见配方8）在4℃过夜振荡。您可以多次使用抗体溶液，但将其储存在4°C，并在使用前检查是否有污染。当抗体信号褪色时，制备新的抗体溶液。
4. 用PBS-T清洗4×5分钟，在室温下振荡。
5. 在阻断缓冲液中准备1：10,000稀释的二抗，约20毫升/印迹。
6. 在室温下振荡时，在二次抗体稀释液中孵育60分钟。
7. 在室温下振荡的同时用PBS-T清洗3×10分钟。
8. 用1ml Luminata forte溶液冲洗印迹并等待几秒钟，完全印迹应覆盖溶液。
9. 在成像机中放置印迹并扫描印迹。
10. 在PBS-T中3×洗涤5分钟。
检测caspase-8和肌动蛋白
1. 重复步骤D3-D10为caspase-8和肌动蛋白抗体检测。使用同种型特异性第二抗体可以在同一膜上检测半胱天冬酶-10后的半胱天冬酶-8。或者，可以使用两个单独的印迹来检测半胱天冬酶-8和10（参见图1C）。

数据分析

检查您的印迹的质量，乐队应该看起来没有任何涂片或气泡。通过向凝胶中添加阳性对照，可以检查印迹的质量和半胱天冬酶片段的检测。例如，caspase-8切割产物p43 / 41和p18应该是可见的（图1C）。可能的阳性对照可能是来自凋亡性死亡细胞（例如，用250ng / ml CD95L刺激120分钟的HeLa-CD95细胞）的裂解物。除了Western印迹数据的定性分析之外，它们也可以量化。这需要在检测范围内的高质量印迹和抗体信号（无过度曝光）。执行定量分析有几种方法可以在这里找到：Schleich等人， 2016。

笔记

小鼠不表达半胱天冬酶-10，它们只表达半胱天冬酶-8。
用于检测半胱天冬酶-8和-10活化的最佳时间点和浓度必须针对每种细胞系和刺激进行优化。
您可以多次使用一次抗体稀释，直到被污染或检测效率正在下降。储存于4°C。
可以使用TBS-T代替PBS-T进行污点清洗。
洗涤缓冲液可用去离子水代替MilliQ水制备。

食谱

1x PBS
对于1升，加入100毫升10倍的PBS至900毫升MilliQ水
蛋白酶抑制剂鸡尾酒（PIC）
1片cOmplete ^TM蛋白酶抑制剂混合物
稀释于2ml MilliQ水中，以接收25x PIC溶液储存于-20°C等分试样
裂解缓冲液（4℃储存）
20mM Tris（pH7.4）
137 mM NaCl
2 mM EDTA
10％甘油
1％Triton
在使用当天添加4％（v / v）25x PIC（见配方2）
Bio-Rad蛋白测定染料试剂（100ml）
对于100 ml加入20ml Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩至80 ml MilliQ水中使用长达3周，并在RT存储
1×Tris /甘氨酸/ SDS 对于1L，将100ml 10×Tris /甘氨酸/ SDS加入到900ml水中
PBS-T
加入2ml Tween-20至2L 1x PBS并混合
阻塞缓冲区
将50g奶粉在1L PBS-T中混合，直到完全解决
初级抗体稀释度
根据制造商的说明（见材料和试剂）在PBS-T中稀释抗体添加叠氮化钠至最终浓度为0.1％（w / v）
将抗体稀释液储存在4°C
4x Laemmli样品缓冲液（还原）
根据制造商的说明书
将900μl4x Laemmli样品缓冲液与100μlβ-巯基乙醇混合

致谢

这项工作得到了RSF 14-44-00011的支持。该协议由Schmidt等人，2015年改编; Pietkiewicz等人，2015年和Schleich等人，2016年。

参考文献

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