材料和试剂

定制柱设计和施工（每列需要材料）
1. 如（Drennan等人，2016）中所述混合的天然有机底物
  1. 苜蓿干草（图2A）
  2. 木片（高沙漠投资公司，凤凰城，亚利桑那州）（图2B）
  3. 锯屑（高沙漠投资公司，凤凰城，亚利桑那州）（图2C）
  4. 石灰石（Imery的3.35-4.95 mm）（图2D）
    
    图2.在柱内部署的固相基质组分的实例。 A.苜蓿干草; B.木片锯末和D.石灰岩。替代的底物如沙子或其他有机固相材料可能与替代应用相关，例如研究地下水或含水层补给。
2. 使用10％NaOH溶液构建连接到塔顶空间的气体收集系统，以捕集和洗涤释放的硫化物，从而限制该毒素的积累（图3）。
  
  图3.生物硫化物的去除生产的气体从塔顶空间行进到连接的塑料袋。通过与10％NaOH溶液反应除去硫化物
水相和固相样品的缺氧柱取样
1. 10ml注射器; Luer-Lok ^®注射器（BD，目录号：309604）
2. 15 ml管; Falcon ^®离心管（Corning，Falcon ^®，目录号：352196）
3. 0.45μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RB）
4. 塑料漏斗（VWR，目录号：300009-435）
5. 石蜡膜（Bemis，目录号：PM992）
6. 铝箔（VWR，目录号：89107-724）
7. 20％二氧化碳平衡氮气认证标准混合物，300缸，CGA-580（Airgas，目录号：X02NI80C3003240）
8. 硝酸; 69.0-70.0％（Avantor Performance Materials，J.T.Baker，目录号：9598-00）
9. 乙醇（VWR，目录号：200057-586）
10. 去离子水（DI）
11. 冰和冷却器（用于运输）
固相底物分离用于地球化学和微生物分析
1. 50ml管; Falcon ^®离心管（Corning，Falcon ^®，目录号：352098）
2. 20％二氧化碳平衡氮气认证标准混合物，300缸，CGA-580（Airgas，目录号：X02NI80C3003240）
3. 乙醇（VWR，目录号：200057-586）

设备

定制柱设计和施工（每列需要材料）
1. 高度为52"（1.32米）内径（ID）6"（0.15米）的清漆PVC管（图1）
2. 尼龙网袋（Phacking 48 in x 25 ft。BetterVue Scereen）（Home Depot Product Authority，目录号：3027671）（图4E）
3. 脉冲热封机（Packco，中西部太平洋，型号：MP-12）
4. 用于流入和流出的Tygon管; ¼"ID和3/8"外径（VWR，目录号：89403-862）
5. 蠕动泵用泵管（4T [尺寸]，蓝白工业）
6. 玻璃大理石（约16毫米直径）填充底部10厘米作为惰性多孔床支撑。或者大玻璃珠也足够了
7. 配件（每种使用一个条目）：
  1. 柱底配件
  2. 流出物样品三通阀（图4A）
  3. 从侧面进行液体取样的阀门（图4B）（每列5个）
  4. 固体样品端口（图4C和4D）（每列3个）
  图4.用于液体和固体基质检索的样品端口。 A.三通阀到样品流出物; B.中间液体采样口; C.中间固相采样口与液体采样口的位置; D.将基材加入到柱中之前的固相端的侧面，将袋子排列在彼此相邻的端口中; E.实验中使用的含有固相底物的牺牲样品袋
8. PVC样品端口允许流动和样品回收（图4D），然后可以将含有固相底物的牺牲袋（图4E）
9. 泵（Flex Flow，最大进料2.3 GFD，蓝白工业）（每列一个）
10. 进料罐（250加仑HDPE鼓）一个罐用于所有柱。
11. 流出物收集罐（30加仑HDPE桶）
12. 定制焊接框架（52"高度）以固定柱体并使其能够进行采样（图5A和4B）。
  
  图5.设备细节的试点规模部署。 A.列之前的列框; B.柱和管道之间的柱架建立。
13. 柱顶空气采集系统（用于擦洗释放的硫化物以防止不安全量的硫化物积聚）
水相和固相样品的缺氧柱取样
1. 重型单级气体调节器（VWR，目录号：55850-277）
2. PVC软管¾在ID（VWR，目录号：89068-590）
3. 写作包（Nasco，Whirl-Pak ^®，目录号：B01196WA）
4. 真空封口机（制造商Rival，型号：FSFGSL0150-015）
5. 真空袋（Seal-A-Meal [11英寸，9英尺卷，2pk]）
6. 解剖钳VWR ^®解剖钳，细尖端，弯曲（VWR，目录号：82027-406）
7. 针鼻多工具; Multi-Plier ^® 600 Needlenose Pliers，Gerber ^®（Gerber Gear，目录号：47550N）
8. Bic经典打火机
9. Sharpie ^®永久墨水笔（VWR，目录号：500020-888）
10. 喷雾瓶用70％乙醇灭菌仪器（VWR，目录号：23609-182）
固相底物分离用于地球化学和微生物分析
1. 厌氧室（Sheldon Manufacturing，型号：Bactron Anaerobic/Environmental chamber）
2. 量表（OHAUS，型号：ES 100 L）
3. 大型称重船（VWR，目录号：10803-168）
4. 剪刀; VWR ^®解剖剪刀，锋利尖端，4½"（VWR，目录号：82027-578）
5. 针鼻多工具; Multi-Plier ^® 600 Needlenose Pliers，Gerber ^®（Gerber Gear，目录号：47550N）
6. 解剖钳VWR ^®解剖钳，细尖端，弯曲（VWR，目录号：82027-406）
7. 喷雾瓶（VWR，目录号：23609-182）

程序

用于代表性固相基底的非侵入性回收的样品袋设计：在3个固相端口（图1和图4D和4E）中的每一个中部署了可渗透的基底袋，以便于空间和时间查询。取出样品袋后，用相同的袋子取代，以规避时间点之间对柱子操作的任何干扰。
1. 确定分析所需材料的质量，并确保样品袋至少含有该量。在这种情况下，3英寸×3英寸的袋子对于1g用于消化的材料和0.5g×3的DNA提取是足够的。剩余材料在厌氧室的Whirl-Paks中厌氧存放，密封在二次真空抽真空的袋子中，然后储存在-20℃。
2. 在多孔尼龙袋（即，蚊帐或窗帘）中均匀包装材料，并确保样品材料与柱材料的其余部分一致。实验开始时，每个采样端口都放置四个袋子。
3. 记录每个样品袋的干质量。
4. 在实验操作期间准备额外的袋子来取代收获的样品，以减少产生的流动扰动
5. 在将实验相关的水（在这种情况下为MIW）中预浸泡袋，然后将其包装在样品端口中以解释膨胀，记录湿重。
使用电感耦合等离子体（ICP-AES）光谱进行含水金属分析的液体样品回收，具有双重视图PerkinElmer Optima Model 5300光谱仪。
1. 需要至少2人进行抽样检索。
2. 确保泵关闭，液体自由流动，以避免拉动真空。
3. 在底物之前收集液体样品以避免任何流动效应。
4. 用N 2/2/CO 2气体混合物冲洗10ml注射器3次，使气体向上推动柱塞。
5. 将漏斗连接到管道上，以确保气体在所关注的区域分散。
6. 在用冲洗的注射器收集10ml液体的同时，持续冲洗含有N 2/2/CO 2混合物的15ml锥形物。
7. 将0.45μm过滤器连接到含有样品的注射器中，并将其过滤的样品在冲洗过程中分配到15 ml管中。
8. 对于ICP-AES分析，用硝酸（在我们的情况下，几滴70％硝酸）将样品的pH值降至2。
9. 拧上盖子和石膏膜，盖上盖子运输。
地球化学分析液体采集
1. 用气体混合物冲洗注射器三次。
2. 用冲洗的注射器收集液体冲洗50ml的管子。
3. 填充50毫升管，不允许头部空间。
4. 拧上盖子和石蜡膜运输。
5. 包裹在铝箔中，以防止硫化物的光氧化（如果适用）
6. 管子含有〜3ml的气体顶部空间，以防止冻结期间开裂。
7. 尽快（48小时内）运行这些样品。
固体底物检索用于地球化学和分子分析
1. 确保流入的水流被关闭。
2. 使用铰接的机架组件倾斜柱，使其平行于地面，以便对基材袋进行采样而无明显的流体损失（图6）。
  
  图6.采样过程中正在使用的完整列和支持硬件。其中一列正在水平倾斜，用于样品袋检索，以实现实验期间的分析。
3. 在打开之前，有一个人在采样端口上持有气体管线。
4. 第二个人将打开样品端口，并使用火焰灭菌的钳子/钳子取回样品袋。
5. 镊子，钳子和其他样品处理工具通过用70％乙醇喷雾而进行火焰灭菌，然后用手持式打火机（即，Bic）点燃，直到酒精燃烧。
6. 将样品袋放入预先冲洗的Whirl-Pak ^®中。
7. 推出大部分的空气，并按照说明将电线"围绕电线"旋转。
8. 将Whirl-Pak-ed样品放入真空袋中，并使用真空封口机进行密封。
9. 将无氧密封的样品立即置于冰上进行分子分析。
10. 将收集的样品用标记的额外样品袋替换为占位符。
11. 替换袋不应作为样品收集，因为它不会与反应性基底接触，只要其他样品袋。
分离用于地球化学和分子分析的底物样品
1. 使用乙醇喷雾瓶，50ml管，15ml管，镊子将解冻的固相样品送入厌氧室（95％：5％N 2：H 2 N 2），钳子，剪刀，称重船和秤。
2. 将50毫升和15毫升的管顶放入撤离单元中，使排气管内的氧气也被清除。
3. 在厌氧室内使用无菌剪刀切开真空密封袋。
4. 从Whirl-Pak ^®中取出样品袋，保持Whirl-Pak ^®完整。
5. 用无菌剪刀切开尼龙样品袋。
6. 将基材置于大型一次性称重船中，并与镊子混合均匀
7. 从样品袋中取出底物，用无菌钳/钳子进行DNA提取。将基材置于预先称量的50ml管中，直至管中有5g湿重。虽然仅使用0.5g x 3进行DNA提取，但是收集5克可以进行冗余。
8. 放置DNA提取管，并收集1g用于地球化学提取的材料，并置于预处理的15 ml管中。
9. 用Parafilm密封15 ml管。
10. 将剩余的材料装回Whirl-Pak ^®。
11. 真空密封Whirl-Pak ^®，从厌氧室出来，并将剩余物料储存在-20°C以进行额外分析。
12. 冷冻-20°C分子分析的材料，除非立即执行

数据分析

如（Zhou，1996; Drennan等人，2016）所述进行包含微生物和地球化学性质的数据收集和分析。反应器的特征在于时间上稳定的社区结构（使用16S rRNA基因识别），其由富含有机器官营养的群体组成，其与硫酸盐还原细菌保持了合成关系。具有超过10％苜蓿干草的柱子被表征为具有比以木片为主的列具有更好的锌去除。这两种底物被选择用于彼此显着不同的细菌群落（Drennan等人，2016）。

笔记

在收集固体基质之前应对液体进行采样，以避免拉动反应性物质导致的流动扰动
我们主张在采样事件之间超过3孔流量，因为这是潜在的破坏性采样方案。
从固体底物中收获的基因组DNA被提取并扩增一式三份，以最大限度地减少与样本异质性相关的并发症。
在某些情况下，感兴趣的金属浓度超出了ICP-AES的限制（特别是对于矿井水流入）。当发生这种情况时，用DI（即，1:10）稀释样品以使样品在检测范围内。采用类似的方法来对抗ICP-AES分析时乙酸钠提取步骤中高钠浓度的并发症（Carlsson et al。，2002）。

致谢

该材料部分基于美国国家科学基金会（CBET-1055396）和美国能源部生物和环境研究办公室（DE-SC0006997和DE-SC0016451）的工作支持。 Freeport-McMoRan Inc.和J. Gust提供额外的财务支持。富克纪念基金（PIAH/12：57）。 RA在第七届欧洲共同体框架计划和卡尔·格瑞格科学研究基金会（CTS 12:11）中通过玛丽居里国际外交奖学金（PIOF-GA-2012-328397）获得支持。

参考文献

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