材料和试剂

1.5ml离心管（Tarsons）
透析管纤维素膜（Sigma-Aldrich，目录号：D9277）
Amicon超离心过滤器（EMD Millipore，目录号：UFC900396）
奶酪布
新鲜提取或冷冻鸡脑组织
酿酒酵母酵母细胞（BY4743菌株）
来自鸡肉的新鲜提取的肝组织
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S7903）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：567440）
丙酮（HiMedia Laboratories，目录号：AS024）
溶胶酶（Sigma-Aldrich，目录号：L4025）
蛋白A琼脂糖珠（GE Healthcare，目录号：17-0963-03）
每硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]（Sigma-Aldrich，目录号：A2939）
考马斯亮蓝R（Sigma-Aldrich，目录号：B0149）
氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：104936）
亚精胺（Sigma-Aldrich，目录号：S2626）
精胺（Sigma-Aldrich，目录号：85590）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：EDS）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：7626）
磷酸氢二钠（EMD Millipore，目录号：106586）
磷酸二氢钠（EMD Millipore，目录号：106370）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
甘油（EMD Millipore，目录编号：104093）
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）（Sigma-Aldrich，目录号：P2714）
醋酸钾（Sigma-Aldrich，目录号：P1190）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
山梨醇（Sigma-Aldrich，目录号：S6021）
氯化镁六水合物（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：63064）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771）
Trizma碱（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
羟基磷灰石树脂（Sigma-Aldrich，目录号：289396）
硫酸（H 2 SO 3 SO 4）（EMD Millipore，目录号：112080）
丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A8887）
GLUD1抗体（Sigma-Aldrich，目录号：SAB2100932-50UG）
注意：本产品已停产。
解决方案1（见配方）
低音解决方案（请参阅食谱）
磷酸钠缓冲液（1M），pH 6.8（参见食谱）
HB缓冲（见配方）
HAP缓冲区（见配方）
醋酸钾溶液（见配方）
前置放电缓冲液（参见食谱）
旋转缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
裂解缓冲液（见配方）
蛋白A琼脂糖珠（50％浆）（参见食谱）
酵母蛋白酶再悬浮缓冲液（参见食谱）
蛋白酶透析缓冲液（见配方）
反应缓冲液

酵母蛋白酶反应缓冲液（参见食谱）
鸡肝蛋白酶反应缓冲液（参见食谱）

10％Triton X-100溶液（参见食谱）
6x SDS-PAGE加载染料（见配方）
10x SDS-PAGE运行缓冲液（参见食谱）

设备

均质器（Pro Scientific，型号：Bio-Gen PRO200均质器）
Potter-Elvehjem PTFE杵和玻璃管（Sigma-Aldrich，目录号：P7734）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-E离心机底盘，Microfuge ^{®/22R离心机）}
超声波发生器（Boston Industries，型号：Branson Digital Sonifier 250& 102C Converter Ultrasonic Dismemberator）
注意：本产品已售完。
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^{TM L/100K超速离心机）}
Bio-Rad电泳电源（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^TM基本电源）
Bio-Rad SDS-PAGE运行装置（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN tetra cell）
振荡器（Eppendorf，型号：New Brunswick ^TM Innova ^® 44）
Rotamer（Tarsons，目录号：3090）
加热块，Thermocell冷却和加热块（Bio-Equip，型号：HB-202）
FPLC冷柜（UniEquip，型号：Unichromat 1500）
Superose ^{TM 6/10/300 GL色谱柱（GE Healthcare，目录号：17-5172-01）}

程序

核心组蛋白的制备
1. 对于蛋白酶测定，需要良好的组蛋白质量。我们从鸡脑组织中纯化了核心组蛋白。要从组织中分离组蛋白需要准备如下所述的细胞核。
2. 通过如下所述的羟基磷灰石亲和纯化（HAP）方法从分离的核中纯化核心组蛋白：
H3蛋白酶的纯化
1. 从酿酒酵母中部分纯化H3-蛋白酶
2. 从鸡肝部分纯化H3蛋白酶
组织体外组蛋白H3切割分析
1. 蛋白酶来源：酵母（BY4743菌株）
2. 蛋白酶来源：鸡
测定后核心组蛋白的可视化
1. 如前所述，通过添加SDS-PAGE加载染料来停止体外的裂解反应。
2. 在95℃下孵育样品5分钟
3. 通过运行18％SDS-PAGE检查组蛋白H3的切割，如图3所示
4. 通过用考马斯蓝色染色染色可视化核心组蛋白条带
  
  图3。 体外组织蛋白H3切割测定与核心组蛋白。 em>活性测定用酵母蛋白酶。 B.用鸡肝蛋白酶进行体外活性测定。在四个核心组蛋白中，只有组蛋白H3被切割，因为蛋白酶特异于组蛋白H3。 " - "和"+"分别表示H3蛋白酶的不存在和存在注意：当蛋白酶新鲜制备时，体外组蛋白H3切割测定法最有效。核心组蛋白应储存在-80℃的小等分试样中。应避免重复冻融组蛋白和蛋白酶。

食谱

解决方案1
0.34 M蔗糖
15mM Tris-Cl，pH7.5
15 mM NaCl
60 mM KCl
0.5mM亚精胺
0.15mM精胺
2 mM EDTA
0.5 mM EGTA
15mMβ-巯基乙醇
0.2 mM PMSF（使用前加入）
低调解决方案
10mM Tris-Cl，pH7.5
15mMβ-巯基乙醇
2 mM PMSF
磷酸钠缓冲液（1M），pH 6.8（100ml） 49毫升1 M磷酸氢二钠 51毫升磷酸二氢钠
HB缓冲区
20 mM HEPES，pH 7.5
0.4 M NaCl
1 mM EDTA
10％甘油
0.1％NP-40
1 mMβ-ME
PIC（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）（使用前加入）
HAP缓冲区
50 mM磷酸钠缓冲液
1 mMβ-ME
PIC（蛋白酶抑制剂鸡尾酒）（使用前加入）
醋酸钾溶液
2克醋酸钾溶于100ml水中
前置放电缓冲器
100mM Tris-Cl，pH8.8
10 mM DTT
球磨缓冲器
50mM Tris-Cl，pH7.5
0.6 M山梨醇
10 mM DTT
洗涤缓冲液
100 mM KCl
50mM HEPES-KOH，pH7.5
2.5mM MgCl 2
0.4 M山梨醇
裂解缓冲液
20mM Tris-Cl，pH8.5
200 mM KCl
25 mM EDTA
1％（v/v）Triton X-100
蛋白A琼脂糖珠（50％浆）
在1.5 ml Eppendorf管中取500μl蛋白A琼脂糖珠在4℃，800 x g离心5分钟
弃上清
加入1 ml裂解缓冲液至珠粒上再次离心并丢弃上清液再次重复两次
最后，将珠粒沉淀在500μl裂解缓冲液中，以获得50％浆液
酵母蛋白酶再悬浮缓冲液
20mM Tris-Cl，pH8.5
200 mM KCl
25 mM EDTA
蛋白酶透析缓冲液
25mM Tris-Cl，pH7.5
100 mM NaCl
10％甘油
1mMβ-巯基乙醇
0.2 mM EDTA
反应缓冲液

酵母蛋白酶反应缓冲液
25mM Tris-Cl，pH7.5
150 mM NaCl
10％甘油
2mMβ-巯基乙醇
0.1mM EDTA
鸡肝蛋白酶反应缓冲液
10 mM HEPES，pH 5.5
100 mM NaCl
1mMβ-巯基乙醇
0.2 mM EDTA
10％甘油

10％Triton X-100溶液
10％Triton X-100（100％）
90 ml水
解决方案通过旋转混合很好
10％解决方案
储存于4°C
6x SDS-PAGE加载染料
2.5ml 4x Tris-Cl，pH6.8
3毫升甘油
1g SDS，0.5ml
1.2毫克溴酚蓝
加水至最终体积至10 ml
10倍SDS-PAGE运行缓冲液
30.0克Trizma底座
10.0克SDS
144.0g甘氨酸
溶解于1000ml H 2 O 3/
中使用前稀释10倍缓冲液至1x

致谢

这项工作得到了生物科技部（印度政府），科学技术部（印度政府）向RST提供的支持。该协议的简短版本在2016年Chauhan等人，2016年Chauhan和Tomar发表。 Azad和Tomar，2016; Mandal 等，2014年; Mandal 等人，2013;曼德勒等人，2012年。CSIR被公认为向Sakshi提供奖学金支持。作者还承认了RST实验室的成员对这项工作的意见。

参考文献

Azad，GK和Tomar，RS（2014）。 Proteolytic组蛋白尾巴的剪切：组蛋白酶在各种生物过程调控中的新兴作用。 Mol Biol Rep。41（5）：2717-2730。
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Bannister，AJ和Kouzarides，T.（2011）。通过组蛋白修饰来调节染色质。 Cell Res 21（3）：381-395。
Chauhan，S.，Mandal，P.和Tomar，RS（2016）。生化分析揭示鸡肝组蛋白H3蛋白酶组蛋白H3剪切的多因素机制。生物化学 55（38）：5464-5482。
Chauhan，S.和Tomar，RS（2016）。有效的表达和纯化生物活性的人类半胱氨酸蛋白酶蛋白质。蛋白质纯化纯化 118：10-17。
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Mandal，P.，Chauhan，S.and Tomar，RS（2014）。谷氨酸脱氢酶的H3剪切活性由stefin B和染色质结构调节。 FEBS J 281（23）：5292-5308。
Mandal，P.，Verma，N.，Chauhan，S.and Tomar，RS（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23673664"target ="_ blank">谷氨酸脱氢酶的意想不到的组蛋白H3尾切割活性。 J Biol Chem 288（26）：18743-18757。
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