材料和试剂

一次性手术刀（Swan Morton，目录号：0510）
带凸轮的培养皿92 x 16毫米（SARSTEDT，目录号：82.1473）
管50毫升，30×115毫米，PP（康宁，猎鹰，目录号：352070）
20毫升偏心尖端注射器（BD，目录号：300613）
针21 G x 1½（BD，目录号：305167）
提示补充（VWR，目录号：89079-464; 89079-470; 89079-478）
70μm尼龙过滤器（Corning，Falcon ^®，目录号：352350）
40μm尼龙过滤器（Corning，Falcon ^®，目录号：352340）
P6孔板（VWR，目录号：734-2323）
P12孔板（VWR，目录号：734-2324）
微量离心管，1.5毫升（VWR，目录号：212-0198）
管10 ml，100 x 16 mm，PP（SARSTEDT，目录号：62.9924.284）
冷冻筒1ml（Greiner Bio One，目录号：123263）
注射器过滤器0.2μm（VWR，目录号：28145-477）
血清学移液管5ml，10ml和25ml（Corning，Falcon ^{，目录号：357543; 357551; 357535）}
小鼠（RjOrl：SWISS和C57BL/6JRj背景 - 6至8周龄男性和女性）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS），游离CaCl 2，不含MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：14190- 094）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270）}
Stem Pro Accutase细胞解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：A1110501）}
Matrigel ^{®基底膜基质（Corning，目录号：354234）}
液氮（由液化气供应）
500mM EDTA（pH8.0）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575-038）}
来自牛血清（BSA）的白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A3294）
高级DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12634-010）
庆大霉素50mg/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15750-037）}
100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）的青霉素 - 链霉素混合物}
两性霉素B250μg/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15290-026）}
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030-081）}
N-2补充100x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：17502-048）}
B-27 w/o vit 50x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12587-010）
1 M HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-056）
乙酰半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：A7250）
生长因子：
重组鼠EGF（Peprotech，目录号：315-09）
重组鼠Noggin（Peprotech，目录号：250-38）
重组鼠CHO衍生的R-spondin 1（R& D Systems，目录号：7150-RS/CF）
重组鼠Fgf10（R& D Systems，目录号：6224-FG）
重组鼠Wnt3a（R& D Systems，目录号：1324-WN/CF）
胃泌素I（Sigma-Aldrich，目录号：SCP0152）
Rho激酶抑制剂Y27632（Sigma-Aldrich，目录号：Y0503）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
丙醇-2（VWR，目录号：1.09634.9900）
乙醇95-97％（VWR，TechniSolv ^{，目录号：84857.360）}
70％乙醇（见食谱）
DPBS-EDTA（10mM）（参见食谱）
DPBS-BSA 2％-EDTA（2mM）（参见食谱）
基础隐窝培养基（BCM）（见食谱）
ENRGWF用于初始播种的培养基（参见食谱）
ENRGWF维护介质（见配方）
冷冻介质（参见食谱）
脱冻介质（参见食谱）

设备

双目（Motic，型号：SMZ-168）
冷光源（肖特，型号：KL1500 LCD）
剪刀：直尖尖（Fine Science Tool，目录号：14090-09和14084-08）
斜角锯齿镊子（精细科学工具，目录号：11080-02）
标准（精细）尖端镊子（精细科学工具，目录号：11251-20）
微解剖刀（精细科学工具，目录号：15018-10）
冷冻离心机（Beckman Coulter，型号：Allegra X-15R）
MaxQ ^TM具有适应温度的摇床（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：MaxQ ^TM 4000）}
生物安全柜（Esco Micro Pte，型号：Class II Type A2）
带喷嘴的移液器20-200μl和100-1,000μl（VWR，目录号：89079-970和89079-974）
细胞培养箱（37℃，5％CO 2）（BINDER，型号：C150）
倒立式明视野显微镜（Motic，型号：AE31）
Nalgene Cryo先生Frosty先生的冷冻容器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：5100-0050）
超低温立式冷冻机（Thermo Fisher Scientific，型号：Thermo Scientificifc Queue Basic）
冷冻系统K系列（泰勒沃顿，型号：24K）

程序

注意：

关于小鼠的一般考虑：动物应在12小时光/12小时黑暗循环的温度（21±1℃）和湿度（55±10％）的控制室内饲养。
除非另有说明，步骤在室温（RT）下进行。

解剖程序和样品的制备
1. 肛门腺分离培养（图1）
  
  图1.步骤A1的总体程序原理图

注意：这些步骤允许隔离可用于在培养物中引起胃组织的成年窦腺（图4）。然而，例如，在FACS之后，单细胞与窦腺分离可能是进行培养的最佳选择。在这种情况下，此协议的用户应遵循步骤A2中所述的修改（见下文）。

图4.成人腺体分离。电镀前或单细胞解离时小鼠窦腺悬液的实例。刻度棒=100μm。

单细胞与窦腺分离（图5）

图5.步骤A2的总体程序原理图

将来自步骤A1z.iii的颗粒重新悬浮在4ml Stem Pro Accutase细胞解离试剂中。
将每个悬浮液转移到P6孔板，并在37℃下用75rpm搅拌孵育40分钟。建议在倒置显微镜下每10分钟检查解离，并通过机械上下移液（微量移液管P1000）帮助该过程。
当达到单细胞悬浮液时，将其通过40μm的过滤器通入新的管中
将管以300×g离心5分钟，4℃。
除去上清液并将沉淀重新悬浮在2ml冰冷的2mM DPBS-BSA 2％-EDTA溶液中以洗涤。
重复两次洗涤。
最后将单细胞制备物重新悬浮在1ml 2mM DPBS-BSA 2％-EDTA中。将细胞悬浮液保持在冰上，并进行染色步骤或在荧光蛋白表达的情况下进行直接分选。建议在分选前再次将悬浮液通过40μm过滤器。
感兴趣的单细胞最终可以在300×g下离心5分钟，4℃。去除上清液，如果需要，进行离体培养的样品种子。

文化 - 3D
1. 开始前的一般准备工作
  在冰上分解Matrigel等分试样并将它们始终保持在冰上，温度的微小变化可能加速不期望的聚合。
2. 根据步骤A中获得的颗粒的大小，选择每个样品的电镀表面和Matrigel的量。对于窦腺悬液的个别样品，建议使用6孔板的1孔和每粒240μl的Matrigel然而，对于分选的样品，可以优选12孔板的1孔和每粒子100μl的Matrigel。所有这些估算可能会根据用户的计划和需求而改变。
3. 用足够量的基质胶重新悬浮在管中，并将悬浮液均匀化在冰上
4. 将混合样品/Matrigel悬浮液以一滴水转移到板上。从中心向下拉伸，直到井底不覆盖墙壁（为此目的使用尖端）（图6a）。
5. 将板放在37℃的培养箱中10分钟，直到混合物聚合。
6. 分配ENRGWF培养基进行初次播种（参见食谱部分）：每孔700μl（12孔板）和每孔1.4 ml（6孔板）。
7. 将板放在培养箱中。
8. 应使用ENRGWF介质进行维护，每隔一天进行一次全面更换（参见食谱部分）。

注意：所有步骤，包括根据样品密度进行电镀的决定，应在倒置的明场显微镜下观察。

图6.初始种子第5天的胭脂红有机物：显示3D培养物（a）的侧视图和第5天（b）的培养的代表性图。比例尺=100μm。

维持有机体
1. 开始前的一般准备工作
  在冰上分解Matrigel等分试样并将它们始终保持在冰上，温度的微小变化可能加速不期望的聚合。
  培养7-10天后（取决于生长速率），应重新组织有机体（图6b）。可以通过"挑选"所选择的元素（步骤C2）或通过收获井的完整部分来完成重新填充（步骤C3）。请看下面每个案例的细节。
2. 按元素选择进行替换
3. 无需选择即可
有机体冷冻保存
1. 冻结协议
2. 去冻原型

数据分析

在免费访问的原始研究论文（Fernandez Vallone等人，2016年）中提供了重复的细节。

笔记

为了优化再现性，建议使用年龄匹配的动物。
为了提高细胞分选后的细胞活力，将单个分选的细胞收集在含有10μMY27632的BCM培养基中。

食谱

70％乙醇
70％乙醇（v/v）在dI水中
DPBS-EDTA（10mM）
1毫升500毫克EDTA在DPBS
最终体积：50 ml
DPBS-BSA 2％-EDTA（2mM）
1克BSA
在DPBS中0.1ml 500mM EDTA 最终体积：50 ml
将溶液通过0.22μm过滤器
基底隐窝培养基（BCM）
500 ml Advanced DMEM/F12补充：
0.4 ml庆方霉素 5毫升青霉素 - 链霉素鸡尾酒库存
5 ml两性霉素B
5ml L-谷氨酰胺（终浓度：2mM）
ENRGWF用于初始播种的培养基
BCM补充：
0.5 ml N-2
1 ml B-27 w/o vit A
0.5 ml 10 mM HEPES
0.1ml 1mM N-乙酰半胱氨酸
生长因子终浓度为50ng/ml，EGF为100ng/ml，Noggin为100ng/ml，CHO-衍生的R-spondin1,100ng/ml Fgf10,100ng/ml Wnt3a，10nM胃泌素和10μMRho激酶抑制剂（Y-27632）
最终体积：50 ml
ENRGWF维护介质
BCM补充：
0.5 ml N-2
1 ml B-27 w/o vit A
0.5 ml 10 mM HEPES
0.1ml 1mM N-乙酰半胱氨酸
生长因子终浓度为：EGF为50ng/ml，Noggin为100ng/ml，CHO衍生的R-spondin为100ng/ml，100ng/ml Fgf10,100ng/ml Wnt3a和10nM胃泌素
最终体积：50 ml
冷冻介质
BCM
1 ml FBS
1 ml DMSO
最终体积：10 ml
脱冻介质
BCM
1 ml FBS
最终体积：10 ml

致谢

这项工作得到了比利时国家比利时科学政策（6/14），比利时Fonds de la Recherche科学院，瓦隆地区（计划CIBLES）和非营利协会RechercheBiomédicale的支持et诊断。该协议从Barker等人的初步报告改编而来。（2010）针对离体培养条件。

参考文献

Barker，N.，Huch，M.，Kujala，P.，van de Wetering，M.，Snippert，HJ，van Es，JH，Sato，T.，Stange，DE，Begthel，H.，van den Born，M ，Danenberg，E.，van den Brink，S.，Korving，J.，Abo，A.，Peters，PJ，Wright，N.，Poulsom，R.and Clevers，H.（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20085740"target ="_ blank"> Lgr5 ^{+ ve}干细胞驱动自我更新在胃中并在体外构建长寿命胃单位。细胞干细胞 6（1）：25-36。
Fernandez Vallone，V.，Leprovots，M.，Strollo，S.，Vasile，G.，Lefort，A.，Libert，F.，Vassart，G.and Garcia，MI（2016）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26989172"target ="_ blank"> Trop2标记了上皮损伤后的过渡性胃上皮细胞和成年再生细胞。 em>发展 143（9）：1452-1463。
Sato，T.，Vries，RG，Snippert，HJ，van de Wetering，M.，Barker，N.，Stange，DE，van Es，JH，Abo，A.，Kujala，P.，Peters，PJ和Clevers， H.（2009）。单个Lgr5干细胞构建crypt-villus结构体外没有间充质的生态位 Nature 459（7244）：262-265。