材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管
铝箔
幻灯片
24 x 32毫米盖玻片（厚度：0.12-0.17毫米）（松本玻璃，目录号：C024321）
18 x 18毫米盖玻片（厚度：0.12-0.17毫米）（松本玻璃，目录号：C018181）
双面胶带（NICHIBAN，目录号：NW-5）
移液器提示
滤纸
E。大肠杆菌BL21（DE3）细胞（Novagen）
pBAD24表达载体（Guzman等人，1995）
pNH319（pBAD24/N-His-FLAG-FlhA）（Minamino等人，2016）
pBAD-PomΔplug（pBAD24/PomA + PomB [Δ41-120]）（Minamino等人，2016）
氨苄青霉素钠（和光纯药工业公司，目录号：014-23302）
L-阿拉伯糖（Wako Pure Chemical Industries，目录号：010-04582）
CoroNa Green-AM（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：C36676）}
乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸，二钾盐，二水合物（EDTA·2K）（Dojindo，目录号：340-01511）
氯化钠（和光纯药，目录号：192-13925）
革兰定酸（Thermo Fisher Scientific，目录号：G6888）
羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
Bacto胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
磷酸二氢钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-22635）
磷酸氢二钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-04295）
T肉汤（见食谱）

设备

（30°C，200 rpm）（TAITEC，型号：BR-40LF）
离心机（能够容纳1.5ml管，以6,000 x g旋转）（TOMY SEIKO，型号：MX-305）
管旋转器（能够容纳1.5ml管，以5rpm旋转）（WAKENBTECH，型号：WKN-2210）
单通道移液管（1,000μl，100μl）（Gilson，型号：P-1000，P-100）
分光光度计（能够测量OD 600）（Shimadzu，型号：UV-1800）
倒置荧光显微镜（Olympus，型号：IX-73）
1. 100x油浸物镜（Olympus，型号：UPLSAPO100XO，NA 1.4）
2. sCMOS相机（安道尔科技，型号：Zyla4.2）
3. 水银光源系统（奥林巴斯，型号：U-HGLGPS）
4. 荧光镜单元（Olympus，型号：U-FGFP [Excitation BP 460-480; Emission BP 495-540]）

软件

Image J（National Institutes of Health， https://imagej.nih.gov/ij/）
KaleidaGraph（Synergy Software）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

注意：执行程序在ca. 23°C，除非另有说明

转换E的能力细胞。用氯化钙处理的大肠杆菌BL21（DE3）菌株与编码FlhA的pBAD24基质粒或PomABΔplug（其是海洋中的Na +）通道复合物鞭毛虫电动机（Morimoto and Minamino，2014）。
在30℃下在含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml T-broth中一式两份生成所得转化体一夜。
接种50微升E过夜培养物。将含有pBAD24的质粒的大肠杆菌BL21（DE3）细胞加入5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的新鲜T培养液中，并在30℃下以150rpm摇动孵育4小时。（细胞密度达到约1.0的OD 600）
加入0.2％阿拉伯糖（终浓度，w/v）以诱导由pBAD启动子在pBAD24载体上衍生的FlhA或PomABΔplug的过量表达，并保持另外1小时的振荡。
1小时后：将200μl每种培养物转移到1.5ml Eppendorf管中，然后通过离心（6,000 x g，2分钟）收集细胞。
使用移液管（P-1000）将细胞沉淀物轻轻悬浮于1.0 ml新鲜结核菌中
以6,000 x g离心2分钟。
弃去上清液。
重复步骤6-8（2 x）。
将细胞重悬于含有40μMCoroNa Green（Invitrogen）和10mM EDTA的100μlT培养液中。
用铝箔盖住管子，使其保持在黑暗中。
使用管旋转器以5rpm旋转管子60分钟。
以6,000 x g离心2分钟。
弃去上清液。
将细胞沉淀悬浮于1.0ml新鲜的T-broth中
以6,000 x g离心2分钟。
弃去上清液。
重复步骤14-16（3 x）。
将细胞重新悬浮在500μl新鲜的T-broth中
通过将双面胶带夹在24 x 32毫米盖玻片（底侧）和18 x 18毫米盖玻片（上侧）之间，形成隧道滑轨（见视频1）。

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视频1.准备隧道幻灯片

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将细胞悬浮液添加到隧道载玻片上，放置5-10分钟，将细胞附着在盖玻片表面上
通过使用移液管（P-100）提供100μl新鲜的T-肉汤，清洗未结合的细胞。用一张滤纸吸收多余的介质。
将样品置于倒置荧光显微镜上
选择一个100x的目标。
使用sCMOS相机每100毫秒，使用GFP（U-FGFP，Ex：460-480，Em：495-540，Olympus）的镜像单元捕获CoroNa Green的荧光图像。
在20μM短杆菌肽和5μMCCCP存在下，测量在含有0mM，5mM，10mM，20mM，50mM或100mM NaCl的T-broth中用CoroNa Green染色的细胞的荧光强度。

数据分析

通过图像分析软件ImageJ（National Institutes of Health）分析荧光图像。

将8 x 8像素的细菌细胞体的荧光图像应用于ROI（感兴趣区域）的矩形掩模。
从每个像素值减去总背景强度。工具背景强度被定义为附近无细胞区域的ROI内的平均像素强度
在每个条件下测量超过100个细胞的CoroNa Green的强度。
在存在20μM短杆菌肽和5μMCCCP的情况下，从各种外部Na ⁺浓度获得的数据进行校准曲线，两者都平衡了内部和外部的Na + E。大肠杆菌细胞（图1）。

图1.使用CoroNa Green的细胞内Na ^{+浓度的校准曲线}使用CoroNa Green染色的细胞的荧光强度在含有20μM短杆菌肽的T-broth中测量，5 μMCCCP在各种Na +浓度（5mM，10mM，20mM，50mM和100mM NaCl）下30分钟。将细胞内CoroNa Green的荧光强度与外部Na +浓度作图，然后通过Hill方程（黑线）拟合。垂直条表示标准偏差。因为CoroNa Green的染色效率在E之间变化很大。大肠杆菌细胞，荧光强度的标准偏差在高Na +浓度时变大。
通过KaleidaGraph（Synergy Software）将校准曲线拟合到Hill方程式。
使用校准曲线，通过每个细胞的CoroNa Green的荧光强度估算细胞内Na ^+浓度。
使用Microsoft Excel（Microsoft）从100多个细胞的数据计算细胞内Na ⁺浓度的平均值和平均值的标准误差。

代表数据

图2.使用CoroNa Green测量细胞内Na ^+浓度。将FlhA或PomABΔplug的过表达对细胞内Na +浓度的影响< E> E。大肠杆菌细胞。在存在和不存在100mM NaCl的情况下，在7.0的外部pH下，用CoroNa Green测量细胞内Na +浓度。 E。用pBAD24（Vector，V），pNH319（FlhA）或pBAD-PomΔplug（PomABΔplug）转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株。对于每个转化体，测量200个细胞。垂直条表示标准错误。（从Minamino等人修改，2016）

笔记

为了研究细胞外钠浓度的影响，使用含有或不含100mM NaCl的T-肉汤进行全部实验
需要10 mM EDTA才能将CoroNa Green加入到E中。大肠杆菌细胞。
为了避免钠的污染，必须使用EDTA·2K（不要使用EDTA·2Na）。

食谱

T-broth
1％Bacto胰蛋白胨，10mM磷酸钾，pH 7.0，含或不含100mM NaCl

致谢

该协议是从以前的工作中修改的（Lo et al。，2006）。该研究部分由JSS KAKENHI Grant Numbers JP15K14498和JP15H05593授予YVM，JP21227006和JP25000013至KN和JP26293097以及TMXT KAKENHI Grant Numbers JP26115720和JP15H01335授予YVM和JP23115008，JP24117004，JP25121718和JP15H01640。

参考文献

Guzman，L.M.，Belin，D.，Carson，M.J.，Beckwith。 J.（1995）。严格的规管，调制和通过含有阿拉伯糖PBAD启动子的载体的高水平表达.J1细菌177（14）：4121-4130。
Lo，CJ，Leake，MC，Berry，RM（2006）。 90（1）：357-365。
Minamino，T。（2014）。通过细菌鞭毛III型出口途径的蛋白质出口。/a> Biochim Biophys Acta 1843（8）：1642-1648。

90（1）：357-365。

Minamino，T。（2014）。 Minamino，T.，Morimoto，YV，Hara，N.，Aldridge，PD和Namba，K。（2016）。细菌鞭毛III型出口门复合体是双燃料发动机，可以同时使用H +和Na +进行鞭毛蛋白质输出。 em> PLoS Pathog 12（3）：e1005495。

Morimoto，YV和Minamino，T。（2014）。双向细菌鞭毛马达的结构和功能生物分子 4（1）：217-234。