材料和试剂

1.5 ml Eppendorf管
双面胶带（NICHIBAN，目录号：NW-5）
玻璃滑梯（Matsunami Glass，目录号：S1126）
18 x 18毫米盖玻片（厚度：0.12-0.17毫米）（松本玻璃，目录号：C018181）
移液器提示
滤纸
沙门氏菌 SJW1103菌株（运动性和趋化性的野生型）（Yamaguchi等人，1984）
MMHI0117菌株[Δfli-fliI flhB （P28T）]（Minamino和Namba，2008）
Bacto胰蛋白胨（BD，目录号：211705）
磷酸二氢钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-22635）
磷酸氢二钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：164-04295）
细菌酵母提取物（BD，目录号：212750）
Bacto琼脂（BD，目录号：214010）
氯化钠（和光纯药，目录号：192-13925）
T型肉汤（TB）（见食谱）
L-肉汤琼脂平板（参见食谱）

设备

选择单通道移液管（1,000μl，100μl）（Gilson，型号：P-1000，P-100）
摇动培养箱（30℃，200rpm）（TAITEC，型号：BR-40LF）
离心机（能够容纳1.5ml管，以6,000×g旋转）（TOMY SEIKO，型号：MX-305）
分光光度计（能够测量OD 600）（GE Healthcare，型号：GeneQuant 1300）
注意：本产品已被制造商停产。
相位显微镜（Olympus，型号：CH40）
1. 40x物镜
2. CCD相机（滨松光子，型号：C5405）
目标千分尺（10μm/间距）
硬盘录像机（松下，型号：DMR-XP25V）

软件

Move-tr/2D（东京图书馆有限公司）
Microsoft Excel（Microsoft）

程序

注意：执行程序在ca. 23°C，除非另有说明

从L-肉汤琼脂平板上挑取一个菌落并将其接种到5ml新鲜结核菌中
在30℃下以150rpm摇动孵育过夜。
将50μl沙门氏菌SJW1103和MMHI0117菌株的过夜培养物接种到5ml新鲜的TB中，并在30℃下以150rpm摇动孵育5小时。（细胞密度达到约1.0-1.2的OD 600）
将100μl培养物转移到1.5ml Eppendorf管中
通过离心（6,000 x g，2分钟）收集细胞。
将细胞沉淀物悬浮于1.0ml新鲜结核菌中。
以6,000 x g离心2分钟。
弃去上清液。
重复步骤4-6。
将细胞重新悬浮于1.0ml新鲜结核菌中。
在玻璃滑板（底侧）和18 x 18 mm盖玻片（上侧）之间夹住双面胶带（见图1和视频1），制作隧道滑轨。

图1.在光学显微镜下观察细菌细胞的隧道载玻片双面胶带夹在玻璃滑块（底侧）和18 x 18 mm盖玻片（上侧）之间。将细胞加入到玻片与盖玻片之间的空间中。观察区域被放大一圈。

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视频1.准备隧道幻灯片

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将细胞悬浮液加入隧道载玻片，用一张滤纸吸收多余的培养基
在相位显微镜的舞台上设置隧道滑梯。
选择40x物镜。
观察相位显微镜下的运动细胞
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视频2.沙门氏菌单元格的游泳

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用硬盘录像机录制10-30秒的动作电池片。
在显微镜下移动视野。
重复步骤14和15超过5次。
在相同的设置中捕获目标测微计的图像。
将录制在硬盘录像机上的电影转换成DVD。

数据分析

使用目标测微计的图像校准电影的比例。
使用运动分析软件Move-tr/2D（Library Co.，Tokyo）跟踪长度为1秒的长度为1秒（30个连续图像以30帧/秒记录）的电影轨道中的运动细胞。
通过Move-tr/2D测量每个单元格的速度（μm/sec）。
使用Microsoft Excel（Microsoft）计算超过30个单元格的数据的平均速度和标准偏差。

图2.沙门氏菌细胞的游泳速度在30℃下生长SJW1103（WT）和MMHI0117（ΔfliHIflhB *）在T-broth中培养4小时，并用相差显微镜观察。垂直条表示标准偏差。（从Minamino等人修改，2016）

笔记

当通过相差显微镜观察运动细胞的游泳时，需要适当的细胞浓度。如果细胞浓度低，在单个影片中仅观察到少量的细胞。如果细胞浓度相当高，每个运动细胞的痕迹重叠，从而使精确的细胞追踪变得困难。游泳动力不受细胞间相互作用影响。
经常观察到非特异性附着在玻璃表面上的细胞，因此不能显示出任何游泳动力。所以这些细胞不能被判断为不能运动的细胞

食谱

T-broth（TB）
1％细菌胰蛋白胨，10mM磷酸钾，pH7.5
L-肉汤琼脂板
1％Bacto胰蛋白胨，0.5％Bacto酵母提取物，1％NaCl，1.5％Bacto琼脂

致谢

该协议是从以前的工作（Minamino等人，2003）修改的。该研究部分由JSS KAKENHI Grant Numbers JP15K14498和JP15H05593授予YVM，JP21227006和JP25000013至KN和JP26293097以及TMXT KAKENHI Grant Numbers JP26115720和JP15H01335授予YVM和JP23115008，JP24117004，JP25121718和JP15H01640。

参考文献

Gabel，CV和Berg，HC（2003）。大肠杆菌的鞭毛旋转电动机的速度随着质子动力线性变化。 100（15）：8748-8751。 >
Minamino，T.和Imada，K.（2015）。细菌鞭毛运动及其结构多样性。 趋势微生物 23（5）：267-274。
Minamino，T.，Imae，Y.，Oosawa，F.，Kobayashi，Y.and Oosawa，K。（2003）细菌鞭毛III型出口门复合物是双燃料发动机，可以同时使用H ⁺和Na ⁺进行鞭毛蛋白质输出。 > PLoS Pathog 12（3）：e1005495。
Minamino，T.and Namba，K。（2008）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18216858"target ="_ blank" > FliI ATP酶和质子动力在细菌鞭毛蛋白质出口中的独特作用。自然 451（7177）：485-488。
Morimoto，YV和Minamino，T。（2014）。双向细菌鞭毛马达的结构和功能。生物分子 4（1）：217-234。
Yamaguchi，S.，Fujita，H.，Sugata，K.，Taira，T。和Iino，T.（1984）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/6374019"target ="_ blank"> H2的遗传分析，沙门氏菌中2期鞭毛蛋白的结构基因。 J Gen Microbiol/em> 130（2）：255-265。