材料和试剂

0.1-10μl移液管吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：QSP＃TF104）}
1-200μl移液管提示（康宁，目录号：4845）
100-1,000μl移液管吸头（康宁，目录号：4846）
1.5ml微量离心管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-A）
1 ml注射器（NIPRO，目录号：4987458080104）
27 G皮下注射针（TERUMO，目录号：NN-2719S）
羽毛一次性手术刀（Sigma-Aldrich，目录号：Z692395）
Falcon 6孔组织培养板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353046）}
C57BL/6NJcl小鼠（男性，6周龄，可从日本CLEA购买，型号：C57BL/6NJcl小鼠）
Vero细胞（可从ATCC购买，目录号：CCL-81）
6-甲酰基吲哚（3,2-b）咔唑（FICZ）（Enzo Life Sciences，目录号：BML-GR206-0100）
玉米油（在室温下储存）（Sigma-Aldrich，目录号：C8267）
水泡性口炎病毒（VSV）（Indiana株：黑田等人，2016）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05913）
VeriKine-HS ^{TM小鼠IFNβ血清ELISA试剂盒（Pestka Biomedical Laboratories，目录号：42410）}
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（"Nissui"②）（NISSUI PHARMACEUTICAL，目录号：05919）
甲基纤维素，4000cps（Sigma-Aldrich，目录号：19-2930）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437-028）}
乙酸（KANTO CHEMICAL，目录号：01021-70）
甲醇（NACALAI TESQUE，目录号：21915-93）
结晶紫（Sigma-Aldrich，目录号：C6158）
甲醛（Wako Pure Chemical Industries，目录号：063-04815）
FICZ解决方案（见配方）
VSV储备溶液（见配方）
固定溶液（见配方）
结晶紫染色溶液（参见食谱）

设备

移液器（PIPETMAN P2）（Gilson，目录号：F144801）
移液器（PIPETMAN P20）（Gilson，目录号：F123600）
移液器（PIPETMAN P1000）（Gilson，目录号：F123602）
离心机
深冻柜
生物安全等级3（BSL3）设施（日立，型号：SCV-1303 ECII-AG）的生物安全罩
Labnet VX100涡流（Labnet International，目录号：13111-LV2）

程序

使用FICZ进行体内治疗

FICZ以10毫克/毫升溶解在玉米油中（见食谱）。
腹腔注射200μl玉米油（作为阴性对照）或10mg/ml FICZ溶液（每只小鼠2mg）。

VSV感染体内

将等分的VSV原液悬浮在PBS中至1.5×10 9 PFU/ml。
用FICZ处理12小时后，用200μlPBS（作为未感染对照）或该病毒溶液（每只小鼠3×10 8 PFU）腹膜内感染小鼠。

测量血清干扰素-β水平和病毒滴度

感染VSV后12小时，使用解剖刀刀片从小鼠尾部切开5mm左右，从小鼠尾静脉采集血液样品。
允许全血凝血，将其在室温下静置30分钟。
通过在4℃下以1,000×g离心10分钟去除凝块。
对于血清干扰素-β水平的测量，使用VeriKine-HS ^{小鼠IFNβ血清ELISA试剂盒。 ELISA根据制造商的方案进行。}
为了测量血清病毒滴度，进行斑块形成测定。在该测定中，6孔板上的5×10 6个Vero细胞用血清样品的病毒感染1小时，并用2ml含有2.4％甲基纤维素和5％热灭活FBS的DMEM覆盖， 24小时。通过以下方法染色活细胞，斑块（，即死细胞的焦点）可以更明显：细胞用1ml固定溶液固定15分钟（参见食谱），然后除去上述的覆盖媒体与流水。将噬斑用1ml结晶紫溶液重新染色15分钟，并用流水洗涤。复染斑块的代表性图像如图1所示

图1.斑块的图像。这是Vero细胞中VSV感染的结果。显示6孔板的一个代表井。活细胞被结晶紫染色，而病毒感染后的死细胞即所谓的"斑块"不被染色。

数据分析

两个样本之间的统计学意义由学生的测试确定。每个样品以七分之一制备（参见Yamada等人的图2d。[2016]）。

食谱

FICZ解决方案
在室温下将10毫克FICZ溶解在1毫升玉米油中。涡旋需要完全溶解。
注意：在本实验中，新鲜制备的FICZ溶液始终不经过过滤使用。
VSV库存解决方案
将VSV用PBS悬浮至2.0×10 9 PFU/ml，并储存在-80℃深冷冻箱中。注意：
2. em>再次使用它也是重要的，因为它可以通过冻结和解冻作用降低病毒滴度。
固定解决方案
固定溶液由30％乙酸和70％甲醇组成
结晶紫染色溶液
用含有0.0005％结晶紫（w/v）和4％甲醛（v/v）<
的PBS制备结晶紫染色溶液

致谢

该协议由Yamada等人（2016）进行了改编。这得到了日本卫生部，劳动福利部，日本教育部，文化部，体育部，科技部（赠予援助科学研究（A））[25253030]和赠款的资助，对创新领域的科学研究援助[25115502,23112701]），加藤纪念生物科学基金会，安田医学基金会，武田科学基金会和日本瓦克斯曼基金会对AT

参考文献

Kuroda，M.，Fujikura，D.，Nanbo，A.，Marzi，A.，Noyori，O.，Kajihara，M.，Maruyama，J.，Matsuno，K.，Miyamoto，H.，Yoshida， Feldmann，H。和Takada，A.（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25855742"target ="_ blank" > TIM-1和NPC1的相互作用对于埃博拉病毒的细胞进入是重要的。 89（12）：6481-6493。
Smirnova，A.，Wincent，E.，VikströmBergander，L.，Alsberg，T.，Bergman，J.，Rannug，A.and Rannug，U.（2016）。< a class ="ke-insertfile" href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26686552"target ="_ blank">用于产生内源芳烃受体激动剂FICZ的新的光依赖途径的证据。 > Chem Res Tpxicol 29：75-86。
Yamada，T.，Horimoto，H.，Kameyama，T.，Hayakawa，S.，Yamato，H.，Dazai，M.，Takada，A.，Kida，H.，Bott，D.，Zhou，AC，Hutin ，D.，Watts，TH，Asaka，M.，Matthews，J.andTakaoka，A。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm。本发明的芳基烃受体信号传导限制I型干扰素介导的抗病毒先天性防御。 Nat Immunol 17（6）：687-694 。