材料和试剂

Tris碱（C 4 H 11 NO 3）（Thermo Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：7647-14-5）
EDTA（Na 2 EDTA; 2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
Triton X-100（Thermo Fisher Scientific，目录号：9002-93-1）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（C 7 H 7 SO 4 S）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
完全蛋白酶抑制剂混合物（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04693159001）
PhosSTOP片剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04906837001）
SDS [CH 3（CH 2）11] OSO 3 [Na]（Sigma-Aldrich，目录号：L3771 ）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：56-81-5）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M7154）
溴酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B0126）
合成完全（SC）培养基
雷帕霉素
甲醇
5x SDS加载缓冲液（参见配方）
酵母细胞裂解缓冲液（见配方）

设备

标准台式离心机
灭菌牙签
孵化器
振动器
1.5 ml eppendorf管
25G针
Western印迹设备
冰箱

程序

使用无菌牙签将酵母细胞从-80℃冷冻库中分离，在标准酵母生长培养基平板中在30℃培养箱中孵育约2天。
在30℃振荡器中将单菌落接种到YPD或合成完全（SC）培养基中过夜
将来自OD 600 = 0.1的传代酵母细胞继续在30℃振荡器中孵育约4-6小时，直到OD 600 = 0.4。
为了用雷帕霉素处理，将最终浓度为200nM的雷帕霉素或药物载体（甲醇）加入细胞培养物中1小时或如其他指示的。
收集酵母细胞，通过在3000×g下旋转15秒钟，而不在冰冻结。
注意：只要酵母细胞保持在YPD和室温下，磷酸化应该预期是相同的。在冰上冷冻10分钟倾向于减轻我手中的磷酸化。用水或PBS缓冲液洗涤也降低磷酸化。
弃去大部分上清液。
将酵母细胞悬浮在剩余的培养基中，并分成1.5ml eppendorf管
在室温下以3,000×g /秒旋转15秒。
收集细胞沉淀，立即加入100μl（对于10ml细胞OD 600 = 0.4）冰冷的细胞裂解缓冲液和相同量的冰冷的珠子。立即通过珠磨机在4℃下破碎细胞1分钟。
注意：不要超过3分钟，否则蛋白质会由于过热而开始脱磷酸。 15秒×5次跳动，45秒钟之间也会降低磷酸化。
如果直接用于Western印迹，加入25μl5x SDS加样缓冲液，涡旋几秒钟
用25G针（在火焰中加热）对管的底部进行孔，并放置在新的埃彭道夫管的顶部。
在3,000×em下旋转5分钟（轻微的spindown将保留一些染色质相关的或强的膜结合蛋白，其可以是磷酸化形式）。
对于诸如磷酸酶处理（CIP测定）的测定，应当立即使用裂解物而不冻融
对于蛋白质印迹，收集80μl裂解物并加入20μl5x SDS加样染料，置于100℃加热印迹5分钟。样品可以在-20℃保存2个月，-80℃保存6个月
根据蛋白质分子量运行建议浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶。尝试50,100,150和200伏，通过使用已知的磷酸化蛋白作为阳性对照来检测磷酸化蛋白。
注意：Maf1的磷酸化不能通过改变丙烯酰胺：双芳基酰胺的比率来检测，而是通过将升高的电压提高到150伏来检测。

食谱

酵母细胞裂解缓冲液
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 0.5mM EDTA 1％Triton X-100 2mM PMSF
Roche完全蛋白酶抑制剂混合物
PhosSTOP平板电脑
使用前请放在冰上。
5x SDS加样缓冲液
60 mM Tris-HCl（pH 6.8）
2％SDS
10％甘油 5％β-巯基乙醇 0.01％溴酚蓝

致谢

该方案从Wei和Zheng（2009）和Wei等人（2009）改编并使用。

参考文献

Wei，Y。和Zheng，X.F。（2009）。 Sch9 部分介导TORC1信号传导以控制核糖体RNA合成。 Cell Cycle 8（24）：4085-4090。
Wei，Y.，Tsang，C.K.and Zheng，X.F。（2009）。通过TORC1调节RNA聚合酶III依赖性转录的机制。 EMBO J 28（15）：2220-2230。