材料和试剂

Nunc ^TM细胞培养处理的多片剂，24孔（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：142475）}
100μl无菌吸头 -
1,000μl无菌移液管尖端
1.5 ml无菌微量离心管
8毫米一次性活检穿孔器（KAI，目录号：BP-80F）
注射器过滤器，minisart，0.20μm（VWR，目录号：514-7011）
细胞：永生化的人类癌相关成纤维细胞（CAFs）（Gaggioli等人，2007）
胶原I型，高浓度，大鼠尾巴（Corning，目录号：354249）
Matrigel ^®基底膜基质，* LDEV-Free（Corning，目录号：354234）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
无菌PBS，pH 7.2（Thermo Fisher Scientific，目录号：20012068）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），苯酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：41966-052）
胰岛素转铁蛋白硒（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：41400045）}
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140-122）}
Y-27632（Sigma-Aldrich，目录号：Y0503）
MEMα，核苷（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11900-073）}
碳酸氢钠，NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
1 M HEPES缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15630080）}
5x胶原蛋白缓冲液（参见食谱）
生长培养基（见食谱）
1ml胶原I型/Matrigel水凝胶（+/-癌症相关成纤维细胞）（参见食谱）

设备

计时器
离心机
移液器
细胞培养箱在37℃，5％CO 2
发现系列混合流变仪（TA仪器，型号：DHR-2）
8 mm几何，图1a（TA Instruments）
8步mm帕尔帖板，图1a（TA Instruments）
不锈钢螺旋桨，一端平头，一端弯头，长6英寸（UNITED SCIENTIFIC SUPPLIES，型号：SSFB06）
血细胞计数器

程序

含有癌相关成纤维细胞的胶原I型/Matrigel水凝胶的制备
1. 将所有试剂置于冰上（胶原I型，Matrigel，生长培养基，5x胶原缓冲液和FBS）。
2. 从细胞吸出生长培养基，并用PBS短暂洗涤细胞。
3. 吸出PBS，并加入足以覆盖细胞的胰蛋白酶-EDTA（0.25％）。
4. 一旦细胞分离，将其重悬于正常生长培养基中并计数细胞
5. 准备凝胶在冰上。对于1ml体积的凝胶按以下顺序添加：
  1. 100μlHN-CAF（500,000个细胞） - 细胞数量需要根据细胞系进行优化（见注释）。使用100μl生长培养基，无需嵌入细胞的水凝胶。
  2. 120μl生长培养基（依赖细胞系，但通常为DMEM，10％FBS，胰岛素转铁蛋白硒，青霉素 - 链霉素）。
  3. 100μlFBS（100％）。
  4. 80μl5x胶原蛋白缓冲液（或根据胶原量计算） - 吸出前旋涡。
  5. 200μl基质胶（或根据所需浓度，见附注）。
  6. 400μlI型胶原蛋白（或根据所需浓度，见附注）。
6. 通过上下移动，不引入气泡，非常好地混合胶原I型/Matrigel水凝胶。在发生气泡的情况下，水凝胶溶液在200 x g下离心几秒钟。
7. 将1ml I型胶原I/Matrigel水凝胶转移到Nunc ^{TM细胞培养处理的Multidishes，24孔板中的一个孔中。避免气泡。如果发生气泡，使用100微升移液管吸头吸出气泡。}
8. 将盖子放在24孔板上，将板转移到培养箱中，不加入生长培养基。
9. 让凝胶在37℃，5％CO 2下聚合1小时。
10. 加入1 ml生长培养基，并将板转移回培养箱（洗涤步骤）
11. 让凝胶在37℃，5％CO 2 洗涤1小时
12. 吸收生长培养基而不接触凝胶。
13. 加入1毫升新鲜生长培养基，并将板转移到培养箱中，37℃，5％CO 2。
14. 使细胞在37℃，5％CO 2的培养箱中重塑其周围的凝胶24-72小时（或直到需要测量）。在使用CAF期间不需要更换介质，但这取决于使用的特定单元格类型。
测量细胞改造凝胶的相对刚度
使用TA Instruments DHR-2控制应变旋转流变仪对所有水凝胶样品进行流变学表征，其使用8mm喷砂平行板几何形状。下表1概述了使用Discovery Series混合流变仪（TA Instruments）确定的上述水凝胶装置的最佳测试参数。

表1.流变仪设置
1. 根据制造商的说明启动和校准流变仪。
2. 将阶梯式下几何形状连接到珀耳帖板（图1a）。
3. 连接8 mm直径的上几何体（图1a）。
4. 将珀尔帖温度设置为所需温度（表1）
5. 零轴向力。
6. 将水凝胶从24孔板中取出，不要使用不锈钢刮刀损坏凝胶（图1b和1c）。
7. 使用8毫米一次性活检穿孔将凝胶修剪成正确的尺寸（图1d和1e）。
8. 小心地将水凝胶装入阶梯式下部几何体（图1f）
9. 根据表1设置对数振荡应变扫描。
10. 根据表1设置固定角度频率。
11. 向上移动8毫米的上几何，直到它接触凝胶的顶部表面（图1g）
12. 将间隙减小50微米，增加施加于水凝胶的轴向力（图1h）
13. 继续，直到达到稳定的0.03 N的轴向力，详见表1.
14. 开始测量。
相对刚度分析
1. 确保在评估的应变范围内的线性粘弹性（储能模量[G']）响应（图1i和1j）。
2. 当比较多个凝胶测量时，提取1％应变下的储能模量（G'）（图1i和1j）。
3. 弹性模量（E）可以使用：
  从储能模量（G'）确定 E = 2×G'（1 +υ）
  哪里，
  υ=水凝胶的泊松比为0.5
  
  图1.流变学设置 a。较低的几何形状，peltier板和上部几何（直径8 mm）。 b。 CAF嵌入的水凝胶在一个覆盖有生长培养基的24孔板中。 C。使用刮刀将CAF嵌入的水凝胶从24孔板中取出。 d。使用8毫米一次性活检穿刺切割直径为8毫米的CAF嵌入式水凝胶活检用于分析。 e。图片说明切除后CAF-嵌入的水凝胶。 F。切下的水凝胶活检置于直径较小的几何（直径8毫米）上。 G。降低上几何形状（直径8 mm）。 H。与水凝胶接触的上几何形状。向水凝胶施加轴向力直到达到0.03N的稳定力。 CAF诱导的I型/Matrigel水凝胶重塑的代表性实例。在CAF重塑72小时后测量胶原型I/Matrigel水凝胶的储能模量（G'）。 CAF在测量后仍然存在于水凝胶中（见注释）。储能模量在十年的振荡应变中测量为0.2％至2％。条形图表示在1％应变下的储能模量，并且示出增加CAF的数量引起水凝胶的硬化。 j。如何通过扰乱ROCK1/2激酶（Rho相关激酶1和2）阻止CAF诱导的I型胶原纤维素水凝胶重塑以及反过来的硬化的代表性实例。在使用10μMY-27632的ROCK1/2激酶的抑制下进行72小时CAF重塑后，测量胶原I/Matrigel水凝胶的储能模量（G'）。测量后，水凝胶中的CAF仍然存在。该图表示在1％应变下的储能模量，并且示出了ROCK1/2-抑制防止CAF重塑和加强其环境。

数据分析

为了确保可靠的数据，请确保在每个实验中执行三个技术重复。当比较多个凝胶测量时，每个技术重复提取1％应变下的储能模量（G'）（图1i和1j）。确保使用适当的对照进行实验三个生物学时间。
确保在评估的应变范围内的线性粘弹性（储能模量[G']）响应（图1i和1j）。如果不是这种情况，不考虑测量。如果这是一个复发问题，应该降低应变范围（小于1％），并提取的储能模量（G'），0.1-0.5％的应变。

笔记

确保胶原I型和Matrigel溶液保持冰冷非常重要。将基底胶在冰上解冻等分（或4℃过夜）。
始终在使用前旋转5x胶原蛋白缓冲溶液。这确保了沉淀的NaHCO 3的良好再悬浮。
细胞数的优化取决于实验的设置。人们必须决定重塑将采取多快的速度。结合到凝胶中的细胞越多，重塑就越快。我们通常建议48-72 h重建高活性细胞如CAF（Madsen等人，2015）。
使用不同浓度的I型和Matrigel胶原将影响水凝胶的初始性质。浓度越高，凝胶的刚度越高。因此，可能需要更多的细胞或更长的重塑周期才能有效地检测实验时间范围内水凝胶的生物力学性质的微小变化。
当使用不同体积的I型和Matrigel胶原时，用生长培养基调整最终体积。
水凝胶嵌入的CAF的活力可以以各种方式确定（Ruedinger等人，2015）：1）可以使用胶原酶/在37℃下分散处理1小时，然后使用血细胞计数器，自动细胞计数器或流式细胞术进行细胞计数。 2）总DNA/RNA水平可以在提取后测定。 3）各种代谢测定，例如MTT，CellTiter-Blue和ATP测定（Ruedinger等人，2015）。
在测试范围内，凝胶的最小频率依赖性，并在所评估的应变范围内显示出线性粘弹性响应（见图1）。
在开始测量之前向凝胶施加轴向力时，请确保测量结果一致。上述凝胶的0.03N值就足够了
始终确保比较同时进行凝胶配对实验的测量。

食谱

5x胶原蛋白缓冲液（5x是指水凝胶中使用的胶原体积）
2.5克MEMα，核苷
5 ml 1M HEPES缓冲液（pH 7.5）
1g NaHCO 3
水可达50 ml
溶解好并过滤灭菌
注意：将主库存存储在-20°C。在4°C储存更小的工作解决方案。
生长培养基
DMEM
胎牛血清（FBS）（10％）
青霉素 - 链霉素（100U/ml）
胰岛素 - 转铁蛋白硒（1x）
1ml具有细胞的I型胶原I型/Matrigel水凝胶 220微升生长培养基（+/-细胞）
80μl5x胶原蛋白缓冲液（或根据胶原量） - 吸出之前的涡流 100μlFBS（100％）
200μlMatrigel（在-80℃下储存等分试样）
400μlI型胶原蛋白（4°C储存）

致谢

该协议改编自以前发表的论文（Madsen等人，2015; Cox等人，2013; Baker等人，2013年）。 TRC由澳大利亚NHMRC新研究者补助金支持。 CDM由瑞典所有的RagnarSöderberg基金会，BioCARE，Cancerfonden和ÅkeWiberg基金会提供支持。我们还感谢Janine Erler教授在生物技术研究与生物技术研究哥德堡大学创新中心提供流变仪。

参考文献

Baker，AM，Bird，D.，Lang，G.，Cox，TR and Erler，JT（2013）。重塑细胞外基质在发育和疾病中的应用。 Nat Rev Mol Cell Biol 15（12）：786-801。
Cox，TR和Erler，JT（2011）。重塑和细胞外基质的体内平衡：对纤维化疾病和癌症的影响。 Dis Model Mech 4（2）：165-178。
Cox，TR，Bird，D.，Baker，AM，Barker，HE，Ho，MW，Lang，G.and Erler，JT（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23345161"target ="_ blank"> LOX介导的胶原交联负责纤维化增强的转移。癌症研究73（6））：1721-1732。
Gaggioli，C.，Hooper，S.，Hidalgo-Carcedo，C.，Grosse，R.，Marshall，JF，Harrington，K。和Sahai，E。（2007）。以成纤维细胞为主导的癌细胞的集落侵袭在前导细胞和后续细胞中的RhoGTPase具有不同的作用。 Nat Cell Biol 9（12）：1392-1400。
Humphrey，JD，Dufresne，ER和Schwartz，MA（2014）。机械转导和细胞外基质体内平衡。 Nat Rev Mol Cell Biol 15（12）：802-812。
Kai，F.，Laklai，H.和Weaver，VM（2016）。强制事项：疾病中细胞侵袭和迁移的生物力学调节。趋势细胞周期 26（7）：486-497。
Kasas，S。和Dietler，G.（2008）。从生物分子到活细胞探测纳米力学性质。 Pflugers Arch 456（1）：13-27。
Madsen，CD，Pedersen，JT，Venning，FA，Singh，LB，Moeendarbary，E.，Charras，G.，Cox，TR，Sahai，E。和Erler，JT（2015）。< a class = -insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26323721"target ="_ blank">缺氧和缺失PHD2使基质成纤维细胞失活以降低肿瘤的僵硬度和转移。 em> EMBO Rep 16（10）：1394-1408。
Picout，DR和Ross-Murphy，SB（2003）。生物聚合物溶液和凝胶的流变学。"科学世界日记" 3：105-121。
Ruedinger，F.，Lavrentieva，A.，Blume，C.，Pepelanova，I. and Scheper，T。（2015）。 3D哺乳动物细胞培养的水凝胶：实验室实践的起始指南。 Appl Microbiol Biotechnol 99（2）：623 -636。