材料和试剂

移液器提示（Tarsons）
5 ml注射器（Himedia）
0.45微米过滤器（Himedia）
的茎外植体
Murashige& Skoog（MS）基础培养基（Murashige和Skoog，1962）（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
Gambrog的维生素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1019）
琼脂（HiMedia Laboratories，目录号：PCT0901）
2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）（Sigma-Aldrich，目录号：D7299）
萘乙酸（NAA）（Sigma-Aldrich，目录号：N0640）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
氯化汞（II）（HgCl 2）（0.01％）（EMD Millipore，目录号：104419）
巴维司汀（1％溶液，斯瓦特农药）
乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
MMS（改良Murashige Skoog）媒体（见食谱）
2,4-D储备溶液（参见食谱）
NAA储备溶液（见配方）
花卉诱导培养基-1（见食谱）
花卉诱导培养基-2（参见食谱）
HgCl 2（0.1％）（参见食谱）
巴伐他汀溶液（1％）（见配方）

设备

0.5-10μl移液器（Transferpette ^®）（BRAND，目录号：704770）
20-200μl移液器（Transferpette ^®）（BRAND，目录号：704778）
100-1,000μl移液管（Transferpette ^®）（BRAND，目录号：704780）
烧杯（200毫升，Borosil）
层层罩（Thermo Fisher Scientific）
锥形烧瓶（150毫升，Borosil）
文化室（Daihan LabTech India，型号：LGC-S201）
高压灭菌器
镊子（ACE Surgical Supply Company，目录号：20-000-48）
烤箱（Hicon India）
水蒸馏装置（Mars Scientific Instruments，目录号：BASIC/pH4& XL）
pH计（CD Hightech，型号：APX 175E）
称重机（Sartorius，型号：BSA224S-CW）
剪刀（一般切割剪刀）

程序

外表面灭菌
1. 以九重葛植物天然生长的镰刀菌反刍植物（2个月大）的节点区域（图1A）为原料。
2. 将一个小块（约20片放在这里）的茧丝反射花瓶内的节茎外植体（1-2厘米长，图1A）。将100毫升1％巴维丝汀溶液中的外植体在层流罩内处理（浸没）10分钟，使其免于灰尘或任何其他外部污染物。
  
  图1.来自Cuscuta reflexa淋巴结外植体的花卉诱导。 A。接种在补充有花诱导激素/激素的MMS培养基中的结节外植体。 B和C.在Cuscuta reflexa nodal外植体中花诱导后拍摄再生，其中MMS培养基用2,4-D和NAA补充。 D.从Cuscuta reflexa 淋巴细胞外植体直接花芽开始，MMS培养基仅补充2,4-D。
3. 用手轻轻晃动，用层压罩内的蒸压蒸馏水冲洗外植体。
4. 将蒸馏水倾倒并将100ml 0.1％HgCl 2加入到同一烧杯中，以在层流罩内进行表面消毒。用手短暂摇动将外植体表面无菌5分钟。
接种外植体进行花卉诱导
1. 接种含有花诱导培养基-1的锥形瓶中的一些外植体（将高达0.5cm的3至4个外植体插入一个烧瓶的培养基（图1A）），并在花诱导培养基-2中接种一些外植体（制备方法花卉诱导培养基-1和-2在食谱部分描述）
2. 将包含培养基的所有锥形瓶与外植体气密密封，以避免任何细菌和/或真菌污染
3. 将锥形瓶保存在组织培养室内，保持受控光（1,000 lux）和温度条件（28±1℃，12小时黑暗/光照期）。
4. 注意节点区域的增殖（图1B）和芽和/或花芽的生成。花大约25到30天才能发芽。
5. 花芽诱导培养基-1（200μl2,4-D/L和200μl在MS培养基中补充的NAA/L）导致开花后开始再生（图1C）。但是花诱导培养基-2（在MS培养基中补充的200μl2,4-D/L）导致花芽起始而没有芽伸长（图1D）。

数据分析

实验重复三次独立。所有的分析都是手动或视觉的。

笔记

植物的结节区域应该被视为外淋巴结，与其他部位相比，新的愈伤组织或分支将迅速发展。
在整个实验过程中，手应适当洗涤和灭菌（含70％乙醇）。
激素在使用前应进行过滤灭菌。
花芽诱导培养基应在锥形瓶或果酱瓶中制备，而不是培养皿，以获得发芽的一些空间。
外植体的表面灭菌不应超过10分钟，因为它可能导致组织损伤。
光，温湿度应保持在文化室内。
如果在培养基表面观察到细菌或真菌污染，外植体应转移到含新鲜培养基的新烧瓶/果酱瓶中。
2,4-D和NAA也可以在高压灭菌之前添加。但如果过滤灭菌，可以在高压灭菌后添加。媒体不需要预先加热激素

食谱

MMS媒体（含有基质MS培养基的修饰MS培养基与Gamborg氏培养基的维生素[Gamborg等人，1968]）

称重4.4毫克容易获得的MS粉末
将4.4mg MS粉末溶于1L蒸馏水中。然后向1升MS溶液中加入30克蔗糖
向1升MS基础溶液中加入1毫升Gamborg维生素溶液
用1N KOH将pH调节至5.8
将8g琼脂加入到培养基中，并在121℃下高压灭菌15分钟

2,4-D库存解决方案
将10毫克2,4-D溶于200微升乙醇中加入800μl蒸馏水，得到1 ml的最终体积然后过滤消毒。
NAA库存解决方案
将10毫克NAA溶于200微升1N NaOH中加入800μl蒸馏水，得到1 ml的最终体积然后过滤灭菌
花卉诱导培养基-1
在高压灭菌后，向1升MMS培养基中加入2毫升过滤灭菌的2,4-D和2毫克的NAA
花卉诱导媒体-2
高压灭菌后，加入2毫升过滤灭菌的2,4-D至1升MMS培养基
HgCl 2（0.1％）
将0.1mg HgCl 2溶解于100ml的高压灭菌蒸馏水中
巴伐他汀溶液（1％）
将1g巴伐他汀溶解在100ml的高压灭菌蒸馏水中

注意：所有的溶液都可以是新鲜的或储存的溶液（4℃，稳定30天）。

致谢

作者感谢Utkal大学植物学系。的奥迪沙财政支持。作者承认Das等人发表的以前的作品。（2011），从该协议适应。

参考文献

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