材料和试剂

1.5ml微量离心管（Ina-optika，目录号：LT-0150）
1 ml移液管吸头（Mettler-Toledo，目录号：768/8 RT-1000）
接种环路（VWR，目录号：12000-812）
3M Micropore 2.5厘米手术胶带（3M，目录号：1530-1）
塑料Petri板（100 x 20 mm）（TrueLine，目录号：TR4002）
塑料Petri板（100 x 15 mm）（VWR，目录号：10053-704）
锥形管（50ml）（LabPlanet，目录号：3181-345-008）
植物材料：拟南芥生态型哥伦比亚（Col-0）用作野生型植物
细菌菌株：丁香假单胞菌pv。将DC3000（ DC3000）在番茄中用作致病菌株。 taliana - Pto DC3000由明尼苏达大学的Fumiaki Katagiri博士亲自提供
乙醇（70％）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：059-07895）
次氯酸钠（Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-02206）
吐温20（和光纯药，目录号：327-32475）
无菌蒸馏水
利福平（50mg/ml）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：185-01003）
Silwet L-77（BMS，目录号：BMS-SL7755）
5％H 2 O 2（和光纯药，目录号：081-04215）
甘露醇（和光纯药，目录号：133-00845）
L-谷氨酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：074-00505）
（和光纯药，目录号：169-04245）
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
MgSO 4·7H 2 O（和光纯药，目录号：131-00405）
琼脂（和光纯药，目录号：010-15815）
NaOH（和光纯药，目录号：192-15985）
Murashige和Skoog基础培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M0404）
蔗糖（和光纯药，目录号：196-00015）
Phytagel ^TM（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
KOH（和光纯药，目录号：165-21825）
媒体

甘露醇 - 谷氨酸（MG）培养基（参见食谱）
一半强度的Murashige和Skoog（MS）媒介（见配方）

设备

高速离心机（TOMY，型号：MX305）
移液器（Mettler-Toledo，型号：Pipet-Lite XLS +）
Labo振动筛（TAITEC，型号：NR-2）
Labo孵化器（AS ONE，型号：ICV-300P）
清洁工作站（日立工业设备系统，型号：CCV-1306E）
分光光度计（JASCO，型号：V-630）
植物生长室（NKsystem，型号：LPH-411SP）
数字秤（AS ONE，型号：IB-300）
砂浆和杵（AS ONE，目录号：6-549-02，φ90mm）

程序

植物生长
1. 在微量离心管中将100-200μg拟南芥种子在70％乙醇中孵育5分钟。
2. 通过离心（500×g×30秒）使种子沉降，并通过移液除去70％乙醇。
3. 用含有0.1％吐温20的6％次氯酸钠孵育种子15分钟，轻轻摇动。
4. 通过离心（500×g×30秒）使种子沉降，并通过移液除去6％次氯酸钠。
5. 用无菌蒸馏水冲洗种子至少四次。
6. 将种子保存在少量无菌蒸馏水（300-500μl）中注意：种子可以在4°C储存。 2天的冷处理提高了萌发率和同步性
7. 在半强度MS板上使用1毫升移液管针头（图1A和视频1），以低密度（50-80种子/板）种植单个种子。
  注意：一半强度的MS板需要在带有封闭盖子的无菌罩工作站中干燥过夜，然后转移表面灭菌的种子。如果一半强度的MS板没有足够干燥，则观察玻璃体和湿的植物。这些植物对病原体接种更为敏感
  
  图1. 拟南芥中的注射方法 A.在半强度MS板上种植种子。 B.用镊子萌发后一周将幼苗转移到新的一半强度MS板上。 C.在光照强度为150-200微米/秒的条件下孵育幼苗24小时和12小时光/12小时暗光周期。 D.用于病原体测定的两周龄拟南芥幼苗。 E.制备。丁香草 pv。 DC3000（ DC3000）接种物。 F.通过将细菌悬浮液分配到板上来进行洪水接种。 G.通过倾析除去细菌悬浮液。 H.用P3 DC3000接种4天后，拟南芥幼苗的疾病表型。
  
  <！ - flashid2106v161开始 - >
  视频1.在半强度MS板上种植种子的步骤
  
  <！ - flashid2106v161结束 - >
8. 将种子在24°C下孵育，光强度为150-200微米/秒/秒/小时，12小时光/12小时暗光周期孵育一周。
9. 将萌发后一周的健康幼苗转移到新的具有镊子的新的一半强度的MS板上（图1B）。
  注意：根系需要放在一半强度的MS板上，不会损坏，每块板上有七棵幼苗对健康植物生长有益。
10. 在24℃的温度下孵育幼苗，光强度为150-200μEm-2至 sec ^{-1和12小时光/12小时暗光周期一周（图1C）。使用两周龄的后发芽幼苗进行病原体测定（图1D）}
细菌生长和接种物准备

在补充有利福平（50μg/ml）的MG琼脂上条纹a -80℃的细菌培养物。在28℃孵育平板直到细菌菌落生长（24-48小时）。

将DC3000的单个菌落接种到具有利福平（50μg/ml）的新MG琼脂上，并在板上连续条纹。在28℃（24-48小时）孵育该板。

用接种环收集尽可能多的细菌菌落并将所有菌落悬浮在适当体积（20-30ml）的无菌蒸馏水中（图1E）。
注意：注意不要取少量的MG琼脂培养基。

测量细菌悬浮液的OD（A600），并用无菌蒸馏水稀释至4×10 6 CFU（菌落形成单位）/ml。
注意：1.0 OD测量大致对应于2×10 8/CFU/ml。

将Silwet L-77加入到细菌悬浮液的最终浓度为0.025％，并轻轻混合。准备后立即使用细菌悬浮液。
洪水接种方法

将40ml细菌悬浮液分配到含有2周龄拟南芥幼苗的板上，并在室温下孵育2-3分钟（图1F）。
注意：一个细菌板通常允许制造超过800毫升的细菌悬浮液。

通过倾析除去细菌悬浮液，并用3M Micropore 2.5 cm手术胶带密封板（图1G）。

将接种的幼苗在24℃下孵育，光强度为150-200μE/秒/秒以上，12小时光/12小时暗光周期。

观察接种2-4天后的症状发展（dpi）（图1H）
细菌生长评估

通过切下下胚轴从单板收集四棵幼苗，以0,1,2和3dpi从Phytagel板分离上述琼脂部分（整个花环），并测量幼苗的重量。
注意：避免收集玻璃体和湿的植物。这些植物对病原体接种更敏感

在具有5％H 2 O 2 O 2的烧杯中对幼苗进行表面灭菌3分钟以确定内部细菌群体并通过浸入无菌蒸馏水中冲洗幼苗三次。
注意：在0dpi的细菌群体从接种后1小时收集的幼苗估计，没有通过H 2进行表面灭菌O ₂

用砂浆和杵将幼苗均匀化至少1分钟，并加入5ml无菌蒸馏水。

将样品从10℃-2小时稀释至10℃-6℃，并用利福平（50μg/ml）在MG琼脂上铺板。
注意：10 ^-2 至10 ^-3 稀释适用于0 dpi和10 到10 /em> 适用于1,2和3 dpi。

孵育板2-3天，并使用适当的稀释样品计数细菌CFU。
注意：2-3天后观察黄色非粘液样菌落

使用接种的幼苗的总重量将CFU归一化为CFU/mg组织。
注意：从至少三个生物复制物评估细菌群体，每个复制品代表在单个板块中生长的单个实验中的四个独立幼苗的合并样品。

数据分析

使用Student's t -test来比较细菌生长的两个平均值，而考虑两次以上细菌生长平均值时，应用ANOVA与事后Tukey的多重校正的诚实显着差异校正。

食谱

甘露醇 - 谷氨酸（MG）培养基
10g甘露醇
2.0g L-谷氨酸
0.5g KH PO 4
0.2克NaCl
0.2g MgSO 4·7H 2 O→// 15克琼脂
用3N NaOH将pH调节至7.0，然后用蒸馏水将体积升至1升，然后进行高压灭菌高压灭菌后加入利福平，将MG培养基倒入塑料培养皿（100 x 15 mm）中
一半强度的Murashige和Skoog（MS）媒介
2.2克Murashige和Skoog基础培养基
10g蔗糖
3.0 g Phytagel ^TM（最终0.3％）
用1N KOH调节pH至5.8，然后用蒸馏水将体积调节至1升，然后再进行高压灭菌将一半强度的MS培养基倒入塑料培养皿（100 x 20毫米）

致谢

这项工作部分得到了传播任期跟踪系统，MEXT，日本和JST ERATO NOMURA微生物群落控制项目的支持。该协议是从以前的工作（Ishiga等人，2011）修改的。

参考文献

Ishiga，Y。和Ichinose，Y。（2016）。 丁香假单胞菌 pv。需要OxyR用于番茄和拟南芥中的毒力。 Mol Plant Microbe Interact 29（2）：119-131。 br />
Ishiga，Y.，Ishiga，T.，Ikeda，Y.，Matsuura，T.和Mysore，KS（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm NADPH依赖型硫氧还蛋白还原酶C通过调节叶绿体产生的活性氧来对抗

病原体的非宿主病抗性发挥作用。一个> 对等J 4：e1938。
Ishiga，Y.，Ishiga，T.，Uppalapati，SR和Mysore，KS（2011）。 拟南芥种苗淹水技术：用于研究植物细菌相互作用的快速可靠的测定。 32.
Ishiga，Y.，Ishiga，T.，Wangdi，T.，Mysore，KS和Uppalapati，SR（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm。 NIRC和叶绿体生成的活性氧调节了丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），pv。（p.No.Gov/pubmed/22112219"target ="_ blank"）。番茄和中的番茄病发展。。 Mol Plant Microbe Interact 25（3）：294-306。