材料和试剂

无菌移液器吸头
手术一次性手术刀（Braun Medical，目录号：5518075）
蠕虫选择铂丝（Genesee Scientific，目录号：59-30P6）
预先扁平的提示（Genesee Scientific，目录号：59-AWP）
显微镜载玻片（76 x 26 mm）（Carl Roth，目录号：0656.1）
盖板（24 x 24 mm）（Carl Roth，目录号：H875.2）
胶带（〜1 mm厚）
Greiner Petri菜（60 x 15毫米）（Greiner Bio One，目录号：628161）
C。线虫菌株（见表1可得转基因）
大肠杆菌OP50菌株（从Caenorhabditis遗传学中心获得）
指甲油
聚酯珠（Polybead，2.5体积％，0.1μm直径）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Carl Roth，目录号：P018.1）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：5066.1）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Carl Roth，目录号：T876.1）
Bacto蛋白胨（BD，目录号：211677）
硫酸链霉素盐（Sigma-Aldrich，目录号：S6501）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）
胆固醇储备溶液（SERVA Electrophoresis，目录号：17101.01）
氯化钙脱水（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
制霉菌素储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：N3503）
琼脂糖（Biozym，目录号：840004）
磷酸盐缓冲液（1M;无菌）（参见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）
M9缓冲区（见配方）
5％琼脂糖垫（见食谱）

设备

解剖立体显微镜（Olympus，型号：SMZ645）
荧光显微镜（ZEISS，型号：Axio Imager Z2，客观EC Plan-Neofluar 10x/0.3）
共聚焦显微镜（我们使用Zeom LSM710共焦显微镜，氩弧多激光源25 mW，波长范围488-640 nm的可调谐激光）（ZEISS，型号：LSM710）
微波
温度稳定的孵化器（AQUA ^® LYTIC培养箱20°C）
比例
圆柱形玻璃烧杯（25ml）（VWR，目录号：213-1120）
高压灭菌器

软件

ZEN 2009软件（或更高版本），德国耶拿Carl Zeiss AG（或控制荧光显微镜或共焦显微镜的任何其他软件）
Microsoft Office 2011 Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）
斐济或ImageJ（ https://fiji.sc/或 https://imagej.nih.gov/ij/）

程序

转基因C的生长和同步。线虫人口
1. 当使用具有整合遗传数组的转基因菌株（表1）时，使用无菌移液器吸头（200μl）从较旧的板切割含有小块（0.5×0.5cm）的含琼脂的动物，并将其转移到新鲜的大肠杆菌（OP50）种子NGM板（参见食谱）。当使用具有非整合的染色体外阵列的转基因品系时，根据选择标记将约25LL幼虫或成年转基因动物挑选到新鲜OP50种子NGM板。
2. 在20℃的标准温度下孵育线虫。
3. 3.5天后，板块含有混合的幼虫阶段。
4. 通过在解剖立体显微镜下在L4阶段挑选〜30个转基因动物并将其转移到单独的OP50种子板上来同步线虫。可以根据外阴区域中的半月形光结构和动物的相对大小（图1）来确定L4阶段。
5. 在20°C将动物生长24小时到第1天成年人，并继续安装样品（程序B）
  
  图1.识别C。线虫混合人群中的幼虫阶段。该图像描绘了在解剖立体显微镜下所见的所有4个幼虫阶段，年轻成年人和第1天的成年人。箭头表示外阴区域的半月形结构，表示L4幼虫阶段。
安装动物成像
1. 准备新鲜的5％琼脂糖垫（见食谱）。
2. 在琼脂糖垫的中心吸移3μl聚苯乙烯珠悬浮液。
3. 使用铂丝从OP50接种板中挑取〜30个转基因进入聚苯乙烯珠悬浮液。
4. 轻轻地将盖玻片放在琼脂/蠕虫悬浮液的顶部，然后继续进行成像程序。任选地，琼脂糖垫可以用指甲油密封，其将保持长时间（> 3小时）成像的湿度。
5. 动物可以从未密封的平板上通过在手术刀的帮助下轻轻抬起盖玻片的一个边缘并加入10μlM9缓冲液来悬挂蠕虫。随后，蠕虫可以用睫毛转移到OP50种子的NGM板上。
用成像光学显微镜成像P体/SG数
1. 启动光学显微镜和成像软件（ZEN，Zeiss）。
2. 将琼脂糖垫放置在荧光显微镜的成像阶段，并定位动物。使用10x的目标来形象整个动物。
3. 使用DIC通道将焦点集中在一个解剖学的地标上。最合适的是位于动物中最中心的横向（水平）位置处的咽的研磨器和内腔（图2A）。
4. 切换到荧光通道，以观察P体或SG特异性荧光，并定义曝光时间和荧光强度。这些参数取决于转基因，必须用经验定义。必须通过降低曝光时间和/或荧光强度来避免荧光信号的饱和度。然而，太短的暴露可能导致检测RNP颗粒的灵敏度降低（图2B）。对于共同表达P体/SG的各种记者的转基因在相应的荧光通道中重复该步骤。
5. 一旦确定了最佳成像条件，就会获取所有荧光通道和DIC通道的快照。拍摄至少25只动物的图像，以获得足够的数据进行统计分析。
6. 将数据保存为图像堆栈。蔡司显微镜产生* .czi文件格式，可由ImageJ/Fiji免费软件处理（参见数据分析）。然而，图像也可以以任何其他通用格式（包括* .jpg，* .png，* .tiff，等）存储/导出和进一步处理，然后继续进行数据分析。 />
  
  图2.表达P体记者DCAP-1 :: dsRED的成年转基因动物的表面荧光图像的代表性图像。用Axio Imager Z2通过10x放大目标记录图像。尺寸棒为100μm。 A. DIC图像。嵌体显示了咽部上的数字增强视图。箭头指出研磨机，在切换到荧光通道之前必须对焦。 B. P体记者DCAP-1 :: dsRED的荧光图像。 C.图像处理的截图。选择多边形选择工具以围绕整个动物。打开分析>测量以获得面积大小和MPI。（转基因动物的全基因型：N 2;出版于Rieckher等人，2015年的Ex [p dcap-1 DCAP-1 :: dsRED; pRF4]）

成像P体/SG数，动力学和colocalization与共聚焦显微镜

启动共焦显微镜和相应的成像软件。

激活适用于P体/SG记者荧光检测的激光。

通过目镜使用传输光将目标物体定位在10x物镜上，并将感兴趣区域（例如，咽部）置于视野的中心。

本地化后，切换到40x目标并重新调整焦点。

在共焦操作软件（采集）中设计了一个z-stack扫描协议。

不同的RNP颗粒在不同转基因和样品中的大小和强度都有显着变化（Teixeira等，2005）。因此，必须在激光功率和增益（光电倍增管[PMTs /检测器的电压]之间根据经验建立平衡，以设置最高和最低检测限。如果可用，请使用智能设置作为起点。尽量避免过度暴露，但通过逐步增加激光功率和/或增益来测试较低的检测限。最终设置必须可重复地应用于所有样品。对于图2中的示例，我们使用570 nm（激发dsRED），激光功率3％和主增益580的可调激光器。

将针孔尺寸保持在1 AU的最佳截面厚度。

z-叠层（切片）之间的距离应该最大为1.5μm。减小z-叠层距离可增强检测较小的RNP颗粒的能力，但增加光漂白。在每个扫描样品中覆盖相似的体积。我们在咽部区域（图2和图3）中以1.5μm的速度进行30个z-叠层。

分配帧大小（分辨率）。我们使用1024 x 1024（图2和3）。

使用透射光检测器（T-PMT）并行产生DIC/Brightfield图像（可选）。

一旦确定了最佳成像条件，就执行荧光通道的扫描。当在相同的转基因中共表达的不同P体/SG成像时，使用顺序扫描来获得额外的荧光通道。获取至少15只动物的数据，以获得足够的数据进行统计分析。

扫描完成后，使用ZEN软件的处理模式产生最大强度投影（MIP），总结了一个图像中所有叠层的荧光强度（图3A和3B）。一致保存为* .czi文件或其他图像文件格式。继续进行数据分析。或者，可以处理和分析单个堆栈或堆栈子集。

图3表示P体报告者DCAP-1 :: dsRED和SG报告子IFE-2 :: GFP的成年转基因动物的咽部区域的代表性图像。使用LSM710共焦显微镜记录图像并处理成MIP。尺寸棒为50μm。 A.P体记者DCAP-1 :: dsRED表达。 B. SG记者IFE-2 :: GFP。 C.通过斐济/ImageJ进行图像处理的截图。使用多边形工具围绕感兴趣区域，分配阈值，并使用"分析粒子"获取有关P体/SG强度，数量和大小的信息。（转基因动物的全基因型：N 2;出版于Rieckher等人的Ex [p dcap-1 DCAP-1 :: dsRED; pife-2IFE-2 :: GFP; pRF4]/em>，2015）

数据分析

用斐济（ImageJ）处理P身体和SG数据

从 https://fiji.sc/下载并安装斐济免费软件。

从共焦激光扫描显微镜通过拖放到斐济软件中，从荧光显微镜或MIP文件打开图像文件。

图像将作为DIC和记录的荧光通道的堆叠打开。在斐济的控制面板中选择了Image>堆叠>堆叠到图像以分割通道。

更改图像>类型> 8位进一步分析步骤。

选择应分析的荧光通道的图像，并应用多边形选择工具进一步缩小感兴趣区域（ROI）。对于从荧光显微镜接收的图像包围整个动物（图2C）。在MIP图像中，应选择特定区域，如咽部（图3C）。

对于落射荧光图像，选择"分析"测量"以获得关于指定区域的任意单位（AU）的面积大小和平均像素强度（MPI）的总结。该信息将显示在单独的窗口中，并可以直接从数据分析软件中复制/粘贴，或者保存为Excel文件（* .xls）。

对于共焦图像，继续测量P体和SG数量和尺寸，必须确定分配单个像素或像素簇以定义荧光RNP颗粒的阈值。选择图像>调整>阈值和经验分配适当的最小/最大值（图3C）。该值将根据转基因，显微镜选择和成像设置而有所不同。一旦分配，这些值必须在每个分析中保持一致。

选择分析>分析粒子并勾选"显示结果"，"汇总"和"排除边缘"，然后按OK（图3C）。

两个单独的窗口显示每个RNP颗粒的"结果"，生成区域（颗粒大小）和平均值（MPI）以及包括"计数"（RNP颗粒数），"总面积"和"平均大小"的"摘要"。这些数据可以直接复制到数据分析软件和/或保存为excel文件。

统计分析

与每个菌株和条件检查的动物数量保持一致。

每个测定应重复至少三（3）次。

使用Mann Whitney或Wilcoxon Kruskal Wallis测试，其显着性截止水平 0.05用于不同组之间的比较，并使用Bonferroni或False Discovery Rate（FDR）进行多次成对比较。

笔记

已知P体和SGs在细胞中的大小和数量上基本上不同（Teixeira等人，2005）。测量变得更加精确，并且当专注于特定组织（例如，肌肉，咽或肠）中的定量和增加样品量时，最终的值代表较小的标准偏差。

食谱

磷酸盐缓冲液（1M）

对于1L，在蒸馏水中溶解102.2g KH 2 PO 4和57.06g K 2 HPO 4，填充1 L.这是一个1M溶液，pH 6.0
在121℃高压灭菌20分钟
在室温下存放

线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

混合3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨，0.2g链霉素，17g琼脂并加入900ml蒸馏水。在121℃高压灭菌20分钟
冷却至55-60°C
加入1ml胆固醇储备溶液，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4，1ml制霉菌素储备溶液，25ml无菌1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0，蒸馏无菌水至1升
移取每个培养皿8毫升培养基，并使其凝固
将板保存在4°C直到使用

M9缓冲液

将3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5L NaCl的1L蒸馏水溶解水
在121℃高压灭菌20分钟
冷却并加入1ml 1M MgSO 4（无菌）
在4°C存储M9缓冲液

5％琼脂糖垫

称重0.5 g琼脂糖，并加入圆柱形玻璃烧杯中
加入10ml M9缓冲液
在微波炉中加热混合物，直到接近沸腾。拿出来，用移液管吸头搅拌，再次煮沸。重复直到琼脂糖完全溶解
通过在中线放置一条磁带来修改两个显微镜幻灯片
在两个录像带之间放置一个空的显微镜载玻片（图4A）
将新鲜的5％琼脂糖溶液（约50μl）滴入载玻片的中部（图4B）
拿第四个显微镜载玻片放在琼脂糖滴上。轻轻按下压扁。胶带用作间隔物以使琼脂糖垫具有特定的厚度（图4C）
让琼脂糖硬化30秒，取出顶部显微镜载玻片
用手术刀将琼脂糖垫的边缘快速切成约20 x 20 mm的正方形
立即进行样品制备（见程序B），因为琼脂糖垫将在大约5分钟内开始干燥
注意：将顶部显微镜载玻片作为盖子包含较长的湿度（约1小时）。因此，可以在实验过程中快速制备和使用几种琼脂糖垫

图4.用于荧光成像的琼脂糖垫的制备。线虫。 A.两片玻璃片用带有侧面为空的显微镜载玻片的带子修改。 B.将一滴50μl5％琼脂糖溶液置于显微镜载玻片的中间（箭头）。 C.迅速将另一个显微镜载玻片放在上面，轻轻将其推下来，使琼脂糖下降。