材料和试剂

50ml一次性注射器（Terumo，目录号：SS-50ESZ）
不锈钢手术刀，10号（FEATHER安全剃刀，目录号：10号）
塑料盘（直径9厘米）（一号，目录号：GD90-15）
玻璃毛细管（1 x 90 mm，无长丝）（Narishige，目录号：G-1）
解剖针：这是通过将30 G针（BD，目录号：305106）连接到尖端被截断的P1000移液器芯片（BM设备，目录号：BIO1000RF）上制成的（图1）
注意：一种手工工具，用于从再生中去除伤口表皮，并用于解剖胚泡。这种针与移植不同（见程序B）。

图1.解剖针
注射器过滤器（0.22μm）（EMD Millipore，目录号：SLGV033RB）
斑马鱼移植供体菌株：Tg（ioctb：loxP-dsred2-loxP-egfp），其组成式表达DsRed2无处不在（Yoshinari等人，2012）。为了简单起见，在本手稿中我们将该行称为Tg（β-actin：dsred2 ）
斑马鱼移植宿主：野生型菌株，通过近交育种在我们的设施中维持
琼脂糖（Nacalai Tesque，目录号：01028-85）
三甲基（3-氨基苯甲酸乙酯）（Sigma-Aldrich，目录号：A5040）
胎牛血清（FBS）（任何品牌都可以使用）
Leibowitz的L-15介质（粉末）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：41300070）}
1M Tris-HCl（pH 9）
L-15培养基（见食谱）
20x三氯生酮储备溶液（见配方）

设备

微波炉
微量拔取器（Sutter Instrument，型号：P-97）
镊子
玻璃皿（直径5厘米）
手术刀柄（FEATHER安全剃须刀，目录号：3号）
Microforge（Narishige，型号：MF-900）
安装在磁铁架上的三维粗略手动操纵器（Narishhige，型号：M-152）
P20微量移液器
荧光立体显微镜

程序

琼脂凝胶阶段的制备（图2）
1. 混合琼脂糖和水，制成2％琼脂糖溶液，并在微波炉中熔化。
2. 将融化的琼脂糖倒入塑料盘中至深达一半的深度，并在室温下放置20-30分钟。
3. 进一步用熔化的2％琼脂糖溶液将盘充满大致全深度，并在室温下放置20-30分钟。
4. 通过切割和去除凝胶上层，在凝胶阶段的中心形成矩形井（2×4cm见方，0.5cm深）。
  
  图2.琼脂糖凝胶阶段
准备移植针
1. 用微量吸管拔出器拉动玻璃毛细管，使针头长而细。我们通常使用与显微注射针相同的条件（我们的设置：热570，拉150，速度120，时间60）拉玻璃毛细管。
2. 将拉针设置在微型锻造件上，用内径约为20μm的位置用镊子打破针头。尽可能使用镊子尽可能的钝。使用微型加热器，使针头平滑，进一步做一个鱼叉。
  
  图3.移植针。 比例尺=50μm。
包括囊胚在内的全再生供体间质细胞的制备（视频1）

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视频1.在再生斑马鱼鳍中包括blastema的间充质细胞移植

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1. 在移植前两天，在塑料盘中麻醉供体斑马鱼，用1克三卡因溶液（约30毫升或足够的体积覆盖鱼体），并用解剖刀切割尾鳍。请注意，宿主鱼的翅片需要同时截肢。截肢鱼回到水族箱，通常喂养直到移植。
2. 在移植当天（截肢后2天[dpa]），用三叉戟麻醉供体鱼，用解剖刀切割翅片再生。
3. 用镊子将翅片再生物转移到含有5-10毫升含有0.01％FBS的L-15培养基的玻璃皿中。
4. 使用解剖针作为镊子从再生（间充质部分）中除去伤口表皮。从近端剥离表皮，通过从边缘轻轻拉扯表皮，去除整个表皮，就好像脱掉T恤一样。
5. 将再生的间充质部分分成各自的翅片射线单元。如有必要，可以进一步将小卵泡切割成较小尺寸。
移植（视频1）
1. 将移植针插入机械手的针座。
2. 麻醉三叉戟的宿主斑马鱼，并将其置于琼脂糖平台上（图4和图5）。
  
  图4.斑马鱼和移植针头
  
  图5.显微镜和机械手设置
3. 使用移植针在伤口表皮表面开口。将针推到再生表面上，然后敲击操纵手柄的头部以破坏表皮。
4. 使用P20微量移液管将包括胚泡发生的供体间充质组织转移到表皮开口部位。
5. 用移植针推动给体间充质组织插入宿主再生。用针头的钩子钩住供体间充质组织，并将其插入宿主再生中。由于供体间质的近端是刚性的，因此更容易钩住近侧。请注意，使用较薄的针很难推动组织。一次可以进行几个鳍状射线的移植，但翅片的背侧或腹侧均应为空白，作为再生控制。
6. 将操作的鱼放回水族馆（图6）。
  注意：

食谱

L-15培养基

根据制造商的说明书溶解L-15粉末
通过0.22μm过滤器进行杀菌

20x三氯生酮储备溶液

将2克三奈因溶于489.5毫升蒸馏水中
加入10.5ml 1M Tris-HCl（pH9）使pH达到7
将溶液以-30℃等分试样储存
用鱼水稀释三氯生酮20倍，制成1×三氯苯胺溶液，用于麻醉。

致谢

这个协议是从我们以前的作品（Yoshinari等人，2012; Shibata等人，2016）改编而来的。这些作品得到了日本科学促进会（JSPS）的科学研究资助。

参考文献

Shibata，E.，Yokota，Y.，Horita，N.，Kudo，A.，Abe，G.，Kawakami，K.and Kawakami，A。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27402707"target ="_ blank"> Fgf信号控制鳍再生的各个方面。开发 143（16 ）：2920-2929。
Yoshinari，N.，Ando，K.，Kudo，A.，Kinoshita，M。和Kawakami，A.（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/23157381"target ="_ blank">彩色的medaka和斑马鱼：由medakaβ-肌动蛋白启动子驱动的无处不在和强大的转基因表达的转基因。发展成长差异 54（9）：818-828。