材料和试剂

酵母细胞
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P8416）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4·3H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：P9666）
山梨醇（C 6 H 14 O 6）（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
BSA（来自牛血清的白蛋白）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP366-1）
37％甲醛溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：F75P1GAL）
酵母聚糖酶（USB，目录号：Z1001）
矢量屏蔽
聚-L-赖氨酸
DAPI
Cytoseal 60
磷酸盐缓冲液（参见配方）
山梨醇缓冲液（见配方）
阻止缓冲区（参见配方）

设备

离心机
振动器
圆锥管
荧光显微镜
15 ml锥形管
光学显微镜
热印

程序

在30℃振荡器中接种酵母细胞过夜
在5ml YPD或确定培养基中OD 600 = 0.1时的亚培养细胞
在30℃下继续振摇4-6小时至1-5×10 7的浓度
将0.6ml的37％甲醛溶液直接加入到细胞中，并在与生长相同的温度下继续振荡孵育90分钟（准确地）。
将细胞转移到15ml锥形管中，并通过在4℃下以660×g离心3分钟沉淀。
吸出上清液，用冰冷的5 ml磷酸盐缓冲液洗涤细胞。在这一步温和，因为酵母细胞在甲醛固定后非常脆弱
Repellet细胞并用冰冷的5ml山梨醇缓冲液洗涤
沉淀细胞并吸出上清液。重悬于〜1ml山梨醇缓冲液中
在30℃预热细胞5分钟。
加入25μl酶解酶，轻轻混合，并在30℃热印迹孵育15-30分钟
在光学显微镜下检查消化（完全消化的细胞是灰色而未消化的细胞是明亮的）
当80％的细胞被消化时，沉淀细胞在4℃下660×g离心3分钟。在0.5ml冰冷的山梨醇缓冲液中轻轻重悬细胞
重复步骤12.
通过在室温（RT）下用聚-L-赖氨酸涂覆载玻片10分钟来制备载玻片
用水冲洗载玻片5次，并在室温下使其干燥
放置20微升的细胞悬浮液在载玻片上的每个孔。在湿室中孵育至少10分钟。
立即将载玻片浸入冰冷的甲醇中6-7分钟。
取出并立即浸在冰冷的丙酮中30秒。
在30°C热印迹上干燥载玻片。
从这一步，不要让井干。用封闭缓冲液洗涤孔几次，并孵育潮湿室至少10分钟。
注意：更长的温育时间可以产生更好的结果，例如，在封闭缓冲液中在4℃孵育过夜。
除去上清液，加入20μl一抗（在封闭缓冲液中稀释）。在潮湿的室内孵育至少2小时。注意：可以将幻灯片在4°C过夜。
吸出过量的溶液，用封闭缓冲液洗5次。
加入20微升荧光共轭二级抗体（在封闭缓冲液中稀释）。
置于黑暗/潮湿的室内约1小时。记住要尽可能保持幻灯片在黑暗中，以防止漂白的荧光。
吸出过量的溶液，用封闭缓冲液洗5次。
然后，用1x PBS洗涤一次。
在1x PBS中稀释DAPI（1：1,000）。
将DAPI溶液加入孔中2分钟。
吸出过量的溶液，并用1x PBS洗涤一次。不要让幻灯片干燥，并添加2μl的VectorHield到井，立即盖玻片。
用Cytoseal 60密封载玻片的边缘，并在荧光显微镜下检查

食谱

磷酸盐缓冲液
在H 2 O中制备0.1M KH 2 PO 4子
在H 2 O中制备0.1M K 2 HPO 4子
将K 2 HPO 4溶液加入KH 2 PO 4溶液中以使pH达到6.5。< br/>
山梨醇缓冲液
0.1M磷酸钾缓冲液（pH6.5） 1.2M山梨醇
阻塞缓冲区
5％BSA的1x PBS（pH 8.0）中洗涤

致谢

该方案改编自并用于Wei和Zheng（2009）和Wei et al。（2009）。

参考文献

Wei，Y。和Zheng，X.F。（2009）。 Sch9 部分介导TORC1信号传导以控制核糖体RNA合成。 Cell Cycle 8（24）：4085-4090。
Wei，Y.，Tsang，C.K.and Zheng，X.F。（2009）。 TORC1调节RNA聚合酶III依赖性转录的机制。 EMBO J 28（15）：2220-2230。