材料和试剂

硼硅玻璃毛细管（World Precision Instruments，目录号：1B100F-4）
石蜡膜（Sigma-Aldrich，目录号：P7793-1EA）
非洲爪蟾卵母细胞（Ecocyte Bioscience，目录号：0-100-2）
载体：使用USER方法（Nour-Eldin等人，2006）携带感兴趣的cDNA的pNB1卵母细胞表达载体。或其他卵母细胞表达载体，如
mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM1344）}
胶原酶D（Roche Diagnostics，目录号：11088882001）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
MES水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
Tris-base（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S271-10）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333）
葡萄糖酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2054）
D-山梨糖醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1876）
庆大霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1272）
ND96缓冲液（参见食谱）
录音缓冲（见配方）

设备

双电极电压钳位放大器（例如，Warner Instrument，型号：Oocyte Clamp OC-725C）
Digidata 1440A低噪声数据采集系统（Molecular Devices，型号：Digidata 1440A）
P-87火焰/棕色微电极微量吸管拔出器（Sutter Instrument，型号：P-87）
渗透计（例如，，Wescor，型号：蒸气压渗透计5500）
微分子（Drummond Scientific，目录号：3-000-510）
定制玻璃管（Drummond Scientific，目录号：3-000-210-G8）

软件

pCLAMP 10电生理学数据采集和分析软件（Molecular Devices）。

程序

准备cRNA
1. 使用USER方法（Nour-Eldin等人，2006）将所有构建体克隆到pNB1卵母细胞表达载体中。
2. 使用来自Thermo Fisher Scientific的mMESSAGE mMACHINE T7试剂盒，从0.5-1μg线性化质粒DNA模板合成cRNA。
卵母细胞的分离
1. 个体的非洲爪蟾卵母细胞可以从Ecocyte Bioscience订购，并在第二天到达干冰。或者，可以如先前报道（Miledi，1982; Gundersen等人，1983;Stühmer和Parekh，1995）所述手术提取卵巢瓣。
2. 为了从卵巢叶中分离卵母细胞，用ND96缓冲液洗涤卵巢瓣3次，在ND96缓冲液中于16℃孵育过夜。
3. 在含有30mg/ml胶原酶D的ND96缓冲液中放置2-3个卵巢，摇动2-3小时以在室温（〜23℃）下除去卵泡细胞层（图1A）。
4. 用ND96缓冲液洗涤卵母细胞5次，对ND96缓冲液中的IV期和V卵母细胞（大约直径1mm，Wasserman等人，1984）进行分类。在注射cRNA前，在16℃孵育ND96缓冲液中的分选卵母细胞过夜，（图1B）
注射cRNA
1. 使用已经去除卵泡细胞层的阶段IV和V卵母细胞（Wasserman等人，1984）。每个mRNA组合注射超过30个卵母细胞。
2. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管在P-87火焰/棕色微电极微量吸管拔出器上拉注射玻璃针，以生产注射针（图1C）。
3. 用镊子切断针尖，以便更容易将cRNA注入卵母细胞（图1D）。
4. 用矿物油填充吸管头至约三分之一至三分之二。
5. 将移液器安装到微型分配器。
6. 将cRNA样品沉积到石蜡膜上，达到总体积的cRNA> 1μl。
7. 通过向移液管施加负压，用微量分散器将移液管与RNA溶液填充。
8. 将cRNA注入选定的卵母细胞。注入卵母细胞的cRNA体积约为50 nl（卵母细胞体积〜500 nl）。注射的cRNA的浓度优于2ng /μl（图1E）。
9. 在记录电流之前，在16℃下将ND96缓冲液中的卵母细胞孵育2-3天
  
  图1.不同步骤的卵母细胞和玻璃针。 A。卵母细胞瓣; B.卵母细胞分离后; C.注射玻璃针前尖端"断"; D."破"针E.注射cRNA的卵母细胞。注意注射移液器不在焦点。 F.用两个电极刺激卵母细胞进行电压钳位。
记录
1. 使用定制玻璃管将P-87火焰/棕色微电极微量吸管拉出器上的记录玻璃电极拉出。
2. 在某些情况下，稍微打破针尖，以便更容易将微量移液管插入卵母细胞，因为针尖可能太软而多次连续注射入卵母细胞。或者，将电极压在卵母细胞上，然后点击记录台。振动有助于刺激卵母细胞。
3. 用3 M KCl填充微量移液器。将一个电极放入两个支架的每一个中，确保Ag/AgCl电极线接触微量移液管中的KCl溶液。填充电极的电阻为0.5-1.5M（图1F）。
4. 对于阴离子通道记录，稳态电流从0 mV的保持电位开始记录，在-20 mV减量范围内从+40到-160 mV范围内记录，然后是-120 mV的电压"尾"脉冲（图2）。 br /> 注意：非洲爪蟾卵母细胞中SLAC1通道电流的时间依赖性质因个体卵母细胞而异。这可能取决于通道蛋白的翻译后修饰。这种性质也从SLAC1编码S型阴离子通道的保卫细胞记录中获得（Schmidt和Schroeder，1994）。
  
  图2. OST1激活非洲爪蟾卵母细胞中的SLAC1阴离子通道电流。 A.用于记录SLAC1阴离子通道电流的电压方案。（B）SLAC1yc和（C）SLAC1yc + OST1yn（在SLAC1yc，SLAC1中）注射了cRNA的卵母细胞记录的全细胞电流曲线的实例用YFP的C末端"半"和OST1yn ，OST1被标记有YFP的N末端'一半'，类似实验的构建参见Geiger等人，2009; Lee等人，2009; Hua < em/et al。，2012; Brandt等人，2015; Wang等人，2016）。
5. 为了评估"单体"脱落酸ABA受体PYL9（Dupeux等人，2011; Hao等人，2011）可以重构SLAC1的激活，将SLAC1yc通道的注射的cRNA，ABI1（ABA-INSENSITIVE1）蛋白磷酸酶，PYL9受体和OST1yn蛋白激酶注入卵母细胞（Geiger等人，2009; Brandt等人，2012）。没有ABA，PYL9没有激活表达ABI1的卵母细胞中具有SLAC1yc和OST1yn的阴离子通道电流。在测量卵母细胞电流30分钟前将ABA注射到卵母细胞中，SLAC1阴离子通道活性在表达SLAC1yc，OST1yn，PYL9和ABI1的卵母细胞中显着增强（图3）。因此，"单体"ABA受体PYL9使ABA信号在卵母细胞中重建
  
  图3.通过PYL9 ABA受体重建SLAC1阴离子通道的ABA活化在-140mV记录的SLAC1阴离子通道的平均电流。在没有ABA的情况下，ABA受体PYL9不能增强SLAC1阴离子通道电流。然而，在注射ABA的情况下，SLAC1阴离子通道电流大大增加。数据为平均值±SEM（SLACyc，n = 9; SLAC1yc + OST1yn，n = 13; SLAC1yc + OST1yn + ABI1，n = 10; SLAC1yc + OST1yn + ABI1 + PYL9，n = 12; SLAC1yc + OST1yn + ABI1 + PYL9 + ABA，n = 15）

食谱

ND96缓冲区
10mM MES/Tris（pH7.5）
1mM CaCl 2
1mM MgCl 2
96 mM NaCl
使用D-山梨糖醇（Geiger等人，2009; Wang等人，2016）将重量摩尔渗透压浓度调节至220mM。
录音缓冲区
10mM MES/Tris（pH7.5）
1mM MgCl 2
1mM CaCl 2
2 mM KCl
24 mM NaCl
70 mM葡萄糖酸钠
使用D-山梨糖醇（Geiger等人，2009; Wang等人，2016）将重量摩尔渗透压浓度调节至220mM。

致谢

该研究由美国国立卫生研究院（GM060396）和国家科学基金会（MCB1616236）向美国科学院院士

参考文献

Brandt，B.，Brodsky，DE，Xue，S.，Negi，J.，Iba，K.，Kangasjarvi，J.，Ghassemian，M.，Stephan，AB，Hu，H。和Schroeder，JI（2012）。通过CPK6重建SLAC1阴离子通道的脱落酸活化和OST1激酶和支链ABI1 PP2C磷酸酶作用。美国Proc Natl Acad Sci USA 109（26）：10593-10598。
布兰特，B.，Munemasa，S.，Wang，C.，Nguyen，D.，Yong，T.，Yang，PG，Poretsky，E.，Belknap，TF，Waadt，R.，Aleman，F.and Schroeder， JI（2015）。脱落酸中的钙特异性信号转导机制信号转导在拟南芥保卫细胞中。 Elife 4：e03599。
Dupeux，F.，Santiago，J.，Betz，K.，Twycross，J.，Park，SY，Rodriguez，L.，Gonzalez-Guzman，M.，Jensen，MR，Krasnogor，N.，Blackledge， Holdsworth，M.，Cutler，SR，Rodriguez，PL和Marquez，JA（2011）。热力学开关调节脱落酸受体的敏感性。 30（20）：4171-4184。

Geiger，D.，Scherzer，S.，Mumm，P.，Stange，A.，Marten，I.，Bauer，H.，Ache，P.，Matschi，S.，Liese，A.，Al-Rasheid，KA ，Romeis，T.和Hedrich，R。（2009）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19955405"target ="_ blank "保护细胞阴离子通道SLAC1的活性由干旱胁迫信号转导激酶 - 磷酸酶对控制。"Proc Natl Acad Sci USA"106（50）：21425-21430。

Gundersen，CB，Miledi，R.和Parker，I.（1983）。由非洲爪蟾卵母细胞中的外来信使RNA引起的电压操作通道.Exp.R Soc Lond B Biol Sci 220（1218）：131-

姚，，Yan Yan Yan Yan，Yan Yan Yan Yan Yan Yan Yan Yan Yan N. N. N. N. N. N. N.））））））））））））。 PP2Cs的ABA独立抑制的分子基础PYL蛋白的亚类。分子细胞 42（5）：662-672。

Hua，D.，Wang，C.，He，J.，Liao，H.，Duan，Y.，Zhu，Z.，Guo，Y.，Chen，Z.和Gong，Z.（2012）质膜受体激酶，GHR <1 >，介导拟南芥中脱落酸和过氧化氢调节的气孔运动。植物细胞24（6）：2546-2561

Lee，SC，Lan，W.，Buchanan，BB and Luan，S。（2009）。将基于尿嘧啶切除的克隆推进到用于克隆PCR片段的理想技术。核酸Res 34/18（18）：e122。 br />

Schmidt，C。和Schroeder，JI（1994）。阴离子通道在保护细胞质膜中的阴离子选择性（大硝酸盐渗透性）。植物生理学106（1）：383-391。

Stühmer，W.和Parekh，AB（1995）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4419-1229-9_15# page-1"target ="_ blank">来自非洲爪蟾卵母细胞的电生理记录。在：Bert S.和Erwin N.（Eds。）。单通道录音。 Springer pp：341-356。

Wang，C.，Hu，H.，Qin，X.，Zeise，B.，Xu，D.，Rappel，WJ，Boron，WF and Schroeder，JI（2016）。重组CO ₂调节SLAC1阴离子通道和功能的CO ₂ - 透明PIP2; 1a通道蛋白作为CARBONIC ANHYDRASE4交互作用。植物细胞 28（2）：568-582。

Wasserman，WJ，Houle，JG和Samuel，D.（1984）。 IV期，V期和VI期非洲爪蟾卵母细胞对体外孕激素刺激的成熟反应。 Dev Biol 105（2）：315-324。