材料和试剂

带有针头的无菌接种环（NUOVA APTACA，目录号：6001/SG/CS）
14-ml聚丙烯圆底管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352059）}
50 ml锥形离心管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：339652）}
安全锁定2毫升管（Eppendorf，目录号：0030120094）
中华根瘤菌中华根瘤菌 1021
2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（TTC）（Sigma-Aldrich，目录号：T8877）
1,3,5-三苯基四唑甲an（Sigma-Aldrich，目录号：93145）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D5879）
胰蛋白胨（Sigma-Aldrich，目录号：T9410）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y0375）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：C3306）
Na 2 HPO 4（AcantorPerformance Materials，J.T.Baker，目录号：4062-01）
NaH 2 PO 4（Acantor，Performance Materials，J.T.Baker，目录号：3818-05）
TYR肉汤培养基（5g/L胰蛋白胨，3g/L酵母提取物，6mM CaCl 2）（参见食谱）
磷酸钠缓冲液（pH 7.5）（参见食谱）

设备

孵化室（30°C）
旋转振动筛
分光光度计（Beckman Coulter，目录号：DU800）
分光光度法在可见光谱中应用的比色杯（Kartell，目录号：1938）
微离心机（SCILOGEX D3024高速微型离心机）（Scilogex，目录号：912015139999）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^TM Megafuge ^TM 16R）}
烤箱（65°C）
余量（Mettler Toledo，目录号：B204-S）

程序

细菌细胞生长
1. 纯文化。在无菌环下取出储存在-80℃的蜜i子1021，接种于含有2.0ml TYR培养基的15ml圆形管中，并在旋转振荡器（200rpm）下于30℃温育24小时，。
2. 将培养物的等分试样（0.15ml）转移到含有15ml新鲜TYR培养基（OD 600）= 0.2的50ml锥形离心管中，并使用分光光度计和比色皿测量在600nm处的光密度用于可见光谱中的分光光度法。
3. 当培养物达到需要约4小时孵育的指数生长期（OD 600）= 0.7时，停止生长并将培养物分成10ml，用于生物质评估，1.5ml用于TTC还原测量。
TTC测定
1. 离心10分钟的细菌培养物在15 ml聚丙烯圆底，5000 x g，20分钟（室温），弃去上清液。
2. 将细胞在65℃下在烘箱中孵育4小时直到干燥，并用平衡称重细胞
3. 将8ml xg的2ml Eppendorf管中的1.5ml细菌培养物离心5分钟（室温）并弃去上清液。
4. 用1ml的50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）洗涤细菌，以8,000×g离心5分钟（室温）并弃去上清液。
5. 将细胞重悬于含有24mM 2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物（TTC）的1ml 50mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）中，并在旋转振荡器上以200rpm温育30℃1小时（图1）
  
  图1.在30℃孵育1小时后细胞悬液的图片
6. 以8,000 x g离心收集细胞5分钟（室温），弃去上清液（图2）。
  
  图2.离心步骤后的细菌细胞的图片
7. 将细胞悬浮于1ml 99.5％DMSO（室温）中以溶解生成的甲。
8. 将细菌细胞以13,000 x g（室温）离心1分钟，收集上清液。
9. 以不同的已知浓度制备甲an标准溶液，将粉末溶解在99.5％的DMSO中
10. 使用分光光度计在510nm处读取样品（上清液）和甲an标准物的吸光度。使用99.5％DMSO作为空白对照
11. 绘制甲an标准品的标准曲线（mg/ml）对溶液在510nm处的吸光度。
12. 从甲an标准曲线中直接测定与细菌细胞反应产生的甲the的量
13. 将数据归一化为对应于1.5ml细菌细胞的细胞生物量（g），并测定每g细胞产生的甲the的量。

数据分析

进行至少五次生物重复，每次在不同时间进行。
Formazan标准曲线的示例在表1中描述。
一些实验样品的读数和它们产生的甲the的量在表2和表3中报告
表1. Formazan标准品及其在510nmv下的相对吸光度

使用分光光度计测定光密度，数据如图3所示。

图3. Formazan标准曲线在0.0075-0.3mg/ml范围内，测定510nm范围内的莫扎唑标准品的光密度。通过使用Excel 2011 for Mac（14.1.0版本）添加了线性回归线。回归线方程和相关系数显示在图表上。

表2.由生成的甲2.的量 S。 meliloti 1021个细胞生长到指数期

通过内插表1中报告并在图1中详细阐述的标准溶液点计算该表中报告的甲烷量。

表3.由生成的甲3.的量 S。 meliloti 1021细胞生长至固定相

通过内插表1中报告的标准溶液点，并在图1中详细阐述，计算了该表中报告的甲The量。

食谱

TYR肉汤培养基（1升）
5克胰蛋白胨
3克酵母提取物
将ddH ₂ O加至1 L.用高压消毒灭菌溶液冷却后，加入12 ml无菌0.5 M CaCl 2 2 /
磷酸钠缓冲液（pH7.5）

通过将1.2g溶解在最终体积的10ml双蒸水中制备1M NaH 2 PO 4溶液
通过将1.42g溶解在最终体积的10ml双蒸水中来制备1M Na 2 HPO 4溶液
混合1.6ml 1M NaH 2 PO 4溶液和8.4ml 1M Na 2 HPO 4溶液并稀释至200ml，用双蒸水制备50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5

致谢

TTC测定的方法由Tachon等人（2009）改编。这项工作得到了意大利经济和财政部向国家研究委员会提供的专项资金的部分支持，该项目是CISIA"Innovazione e Sviluppo del Mezzogiorno" - Conoscenze Integrate perSostenibilitàed Innovazione del Made in Italy Agroalimentare - Legge No. 191/2009"。这项工作也得到了欧盟委员会资助ABSTRESS项目（FP7 KBBE-2011-289562）的部分支持。作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献

Berridge，MV，Herst，PM and Tan，AS（2005）。生物技术公司Annu Rev。11：127-152。
Byth，HA，Mchunu，BI，Dubery，IA和Bornman，L。（2001）。评估一种简单，无毒的阿尔玛蓝细胞存活实验来监测番茄细胞的活力。 Phytochem Anal 12：340-346。
Hayashi，S.，Kobayashi，T。和Honda，H。（2003）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16233537"目标="_ blank">使用四唑紫色染色方法进行简单快速的细胞生长测定，用于筛选有机溶剂耐受细菌。 J Biosci Bioeng 96（4）：360-363。 />
Lin，YC，Agbanyim，CN，Miles，RJ，Nicholas，RA，Kelly，DP and Wood，AP（2008）。用于评估支原体中底物氧化和菌株分化的四氮唑还原方法，特别是参考支原体支原体和 Mycoplasma mycoides cluster。 J Appl Microbiol 105（2）：492-501。
Raut，U.，Narang，P.，Mendiratta，DK，Narang，R。和Deotale，V.（2008）。用于检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的药物敏感性的快速MTT管法的评估印度J Med Microbiol 26（3）：222-227。
Tachon，S.，Michelon，D.，Chambellon，E.，Cantonnet，M.，Mezange，C.，Henno，L.，Cachon，R.and Yvon，M。（2009）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19520722"target ="_ blank">实验条件影响乳酸杆菌电子传递链中四唑紫还原的位点乳酸菌。 微生物学 155（Pt 9）：2941-2948。
Tengerdy，RP，Nagy，JG和Martin，B.（1967）。通过还原四唑盐进行细菌生长的定量测量。应用微生物15（4）：954-955。