材料和试剂

W303a野生型酵母细胞
Tris碱（C 4 H 11 NO 3）（Thermo Fisher Scientific，目录号：77-86-1）
NaCl（Thermo Fisher Scientific，目录号：7647-14-5）
Na 2 EDTA·2H 2 O（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS）
Triton X-100（Thermo Fisher Scientific，目录号：9002-93-1）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（C 7 H 7 SO 4 S）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
完全蛋白酶抑制剂混合物（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04693159001）
PhosSTOP片剂（F.Hoffmann-La Roche，目录号：04906837001）
甘油（Thermo Fisher Scientific，目录号：56-81-5）
MgCl 2（USB，目录号：18641 500 GM）
二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，Pierce Antibodies，目录号：20290）
雷帕霉素（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-3504）
玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G-8772）
HA抗体（12CA5）（Abcam，目录号：ab16918
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A2383-1G）
[γ-^{32 P] -ATP（PerkinElmer，目录号：BLU002250UC）}
考马斯蓝R250（National Diagnostics，目录号：HS-605）
HCl
2.5x SDS装填染料
IP缓冲区（参见配方）
激酶缓冲液（参见配方）
PBS缓冲液（见配方）

设备

标准台式离心机
振动器
1.5 ml Eppendorf管
作者日历

程序

接种含有载体 pRS315-SCH9-HA3 及其激酶死亡形式（K441A）和多动型（2D3E）的W303a野生型或W303a细胞在10ml SC-His-培养基中过夜。在30℃下剧烈振荡（300rpm）。
在含有100ml YPD的2个烧瓶中传代酵母细胞，起始OD 600 = 0.2。
在30℃下剧烈振摇至OD 600 = 0.5（使用YPD而不是SD培养基是重要的）。
向一个烧瓶中加入200nM雷帕霉素和另一种媒介物对照。在30℃下剧烈振荡30分钟
在室温（RT）下以3,000xg 旋转以收集细胞（重要的是避免冻结）。
弃去大部分上清液，然后将酵母细胞悬浮在剩余的培养基中，并分成5×1.5ml Eppendorf管（20ml细胞培养物/管，一个管中的更多细胞未充分分解）。
收集细胞沉淀，立即加入200μl冰冷的IP缓冲液和相同量的玻璃珠。
立即通过珠磨机在4℃下破碎细胞1分钟。注意：不要超过3分钟，否则激酶活性会由于过热而开始下降。 15秒×5跳动与45秒之间也降低Sch9激酶活性。
通过在20000×g下旋转收集细胞裂解物，在4℃下10分钟。组合裂解物。
立即向1mg /500μl细胞裂解液中加入1μgHA抗体（12CA5），在4℃下轻轻旋转1小时。
用IP缓冲液洗涤蛋白A/G珠3x。加入50微升（100微升50％浆液）细胞裂解液，进一步旋转1小时
旋转和收集珠。用0.5ml冰冷的IP缓冲液洗涤3次。
加入0.5 ml 1x冰冷的激酶缓冲液。保存50微升在另一个1.5毫升的Eppendorf管用于与HA抗体的western印迹
离心并加入免疫复合物100μMATP，0.5μg细菌表达的GST-Maf1在50μl激酶。
向反应体系中加入50μCi[γ-32 P] -ATP。涡旋并在30℃孵育15-30分钟
通过在2.5x SDS加载染料中在100℃加热5分钟来终止激酶反应
一半的样品应进行SDS-PAGE。底物将通过考马斯蓝染色检测
使用凝胶干燥器在80℃下干燥凝胶2小时。基质的磷酸化通过作者自显示

食谱

IP缓冲区
50mM Tris-HCl（pH7.5） 150mM NaCl 0.5mM EDTA 0.5％Triton X-100 在使用前加入2mM PMSF，Roche完全蛋白酶抑制剂混合物和phosSTOP片剂。改变NaCl浓度或/和Triton X-100水平以获得不同激酶和不同抗体的最佳条件。
1x PBS（pH 7.4）
激酶缓冲液
1x PBS（pH 7.4）
20％甘油 4mM MgCl 2/
10 mM DTT
蛋白酶抑制剂

致谢

该方案改编自并用于Wei和Zheng（2009）和Wei et al。（2009）。

参考文献

Wei，Y。和Zheng，X.F。（2009）。 Sch9部分介导TORC1信号转导以控制核糖体RNA合成。细胞周期 8（24）：4085-4090。
Wei，Y.，Tsang，C.K.and Zheng，X.F。（2009）。 TORC1调控RNA聚合酶III依赖性转录的机制。 EMBO J 28（15）：2220-2230