材料和试剂

Amicon超离心过滤器，30K（Merck Millipore，目录号：UFC903096）
Amicon超离心过滤器30,000 MWCO（EMD Millipore，目录号：UFC803024）
经济型生物技术透析膜，14KD（Sangon Biotech，目录号：TX0111）
大肠杆菌（大肠杆菌）（BL21）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C6000-03）}
pET32aM（Novagen，通过在NcoI切割位点插入TEV proteasecut位点从pET32a修饰）（图1）
水稻（NM_001057650，残留201-578）
氨苄青霉素（Sangon Biotech，目录号：A100741）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sangon Biotech，目录号：A100487）
螯合Sepharose Fast FLow（GE Healthcare，目录号：17057502）
硫酸镍（II）六水合物（NiSO 4·6H 2 O）（Sangon Biotech，目录号：A600658）
咪唑（Sangon Biotech，目录号：A500529）
TEV（tabacco蚀刻病毒）蛋白酶（室内生产）（Fang等人，2007）
胰蛋白胨（Oxoid，目录号：LP0042）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
氯化钠（NaCl）（Sangon Biotech，目录号：A501218）
琼脂（Oxoid，目录号：LP0011）
三碱基（Sangon Biotech，目录号：A100826）
盐酸（HCl）（国药化学试剂，目录号：7647-01-0）
甘油（Sangon Biotech，目录号：A100854）
乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（Sangon Biotech，目录号：A100105）
β-巯基乙醇（AMRESCO，目录号：60-24-2）
吐温-20（Sangon Biotech，目录号：A100777）
无水乙醇（Sangon Biotech，目录号：A500737）
磷酸邻（85％）（Sangon Biotech，目录号：A502803）
乙酸（Sangon Biotech，目录号：A501931）
考马斯亮蓝G-250（Sangon Biotech，目录号：A100615）
考马斯亮蓝R-250（Sangon Biotech，目录号：A100472）
SDS（Sangon Biotech，目录号：A100227）
异丙醇（Sangon Biotech，目录号：A507048）
LB培养基（参见食谱）
LB-琼脂平板（参见食谱）
裂解缓冲液（见配方）
色谱缓冲液（参见食谱）
考马斯亮蓝G-250缓冲液（参见食谱）
SDS-PAGE染色溶液（参见食谱）
SDS-PAGE脱色溶液（参见食谱）

图1. pET32aM质粒的图谱

设备

2升烧瓶
分光光度计装置（Kebo仪器，型号：UV-1100）
超声波仪（Scientz，型号：IID）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
色谱系统（GE Healthcare，型号：INV-907）
注意：本产品已停产。
HiLoad 16/600 Superdex 200（GE Healthcare，目录号：28-9893-35）
电泳系统（Liuyi，型号：DYY-6D）

程序

将编码GRAS结构域Os-SCL7的基因（NM_001057650，残基201-578）克隆到修饰的pET32a载体（pET32aM）中（图1）。
将通过DNA测序验证的重组质粒（OsSCL7 201-578 -pET32aM）通过热休克法（Hanahan，1983）转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）），并在含有100mg/L氨苄青霉素的LB-琼脂平板上在37℃下培养12小时
选择一个殖民地并培养E。大肠杆菌在含有100mg/L氨苄青霉素的10ml LB培养基中在37℃下培养5小时。然后将10ml培养物转移到含有100mg/L氨苄青霉素（2L烧瓶）的1L新鲜LB培养基中，并在37℃下培养直至OD 600nm达到0.4-0.6。
将培养物冷却至约16℃，然后在16℃，180rpm下用0.3mM IPTG诱导蛋白质表达12-14小时。
通过以8,800×g离心收获细胞5分钟并丢弃上清液，然后通过涡旋将细胞悬浮在50ml裂解缓冲液中。
用380W的功率将重悬细胞在冰上超声处理30分钟（超声处理设置为2秒'开6秒'，并重复该循环）。
注意：蛋白质应始终保持在冰上，避免超声波过程中产生的高能量。在这个过程中，间隔时间应该更好（这里超声波处理设置为三次，每次10分钟，每两次间隔2分钟）。
超声处理后，将样品以18,000 x g离心30分钟。
将上清液转移到新管中，向上清液中加入咪唑至最终浓度为20 mM，并彻底混合。保持沉淀（含有细胞碎片和蛋白质聚集体）在冰上进行SDS-PAGE（步骤11）。
注意：将最终浓度为20 mM的咪唑加入上清液可以有效降低非特异性蛋白质的结合。
将样品加载到用裂解缓冲液预平衡的镍 - 琼脂糖亲和树脂（Chelating sepharose Fast FLow）上。
用含有咪唑（10mM，20mM，50mM和500mM）梯度的裂解缓冲液洗脱结合的蛋白质。
将洗脱的蛋白质与加载缓冲液混合以进行SDS-PAGE（图2a）。根据与TRX和6His标签融合的OsSCL7 GRAS结构域的分子量59kDa，感兴趣的蛋白质应在45kDa至66.2kDa之间。
注意：为了获得高纯度蛋白质，最好使用一系列浓度的咪唑洗涤非特异性结合蛋白，并确保咪唑浓度几乎不能洗脱任何蛋白质（见注释）。目标蛋白质在500mM咪唑洗脱液中。
将TEV蛋白酶加入目标洗脱的蛋白质（mTEV：mprotein = 1:10），以从OsSCL7 GRAS结构域中除去TRX和6His标签。然后将混合物转移到透析膜上，并在旋转器上的裂解缓冲液中在4℃下透析过夜。
注意：在该步骤中，裂解缓冲液用于将咪唑透析至低浓度，通常低于5mM。
将裂解的蛋白质再次装入镍 - 琼脂糖亲和树脂上。目标蛋白质流经和随后的20mM咪唑洗脱液。根据OsSCL7 GRAS结构域的分子量42kDa，靶蛋白的条带在35和45kDa之间（图2b）。
然后将样品加载到预先用1.2柱体积的色谱缓冲液预平衡的HiLoad 16/600超级200柱（图3a）中。通过SDS-PAGE评估OsSCL7单体和二聚体的样品（图3b）。
收集含有目标蛋白的级分，并将样品浓缩至5至8mg/ml，通过Bradford方法在分光光度计装置（Bradford，1976）上测量，使用Amicon Ultra离心过滤器进行随后的结晶实验。

数据分析

图2.用考马斯亮蓝染色的镍琼脂糖亲和树脂纯化的OsSCL7 GRAS结构域的15％SDS-PAGE分析。 a。泳道1：聚集体（在步骤8中生产）;泳道2：流（步骤8）;泳道3：用20mM咪唑洗脱;泳道4：用500mM咪唑洗脱; M：标记箭头表示与预期的MW（59kDa）的OsCL7GRAS结构域（41.5KDa）+ Trx-标签（17.5KDa）相似的MW。 b。泳道1：根据OsSCL7 GRAS结构域的MW，约42kDa，第二次镍琼脂糖亲和力树脂纯化（在步骤11中产生，TRX和6His标签从OsSCL7 GRAS结构域切断）的流动;泳道2：用20mM咪唑洗脱，其还含有OsSCL7 GRAS结构域; M：标记。

图3.通过大小排阻色谱法纯化OsSCL7 GRAS域。 a。尺寸排阻色谱法（HiLoad 16/600 superdex 200柱），OsSCL7 GRAS结构域的二聚体和单体分别为72.26和79.68 ml，分子量分别为84 kDa和42 kDa。 b。 15％SDS-PAGE分析纯化的OsSCL7 GRAS结构域，从大小排阻层析中观察到的峰的部分，显示出高纯度。

笔记

这里制备的TEV蛋白质必须足够纯（超过90％），而第二种镍 - 琼脂糖亲和性树脂步骤对于OsSCL7-GRAS结构域纯化是重要的。
进行预实验以确定咪唑的浓度将很好地洗脱靶蛋白
咪唑的系列浓度用于洗涤非特异性结合蛋白（该步骤中使用的最高浓度的咪唑必须低于靶蛋白的洗脱浓度）。考马斯亮蓝G-250缓冲液（参见食谱）用于检测每个浓度的咪唑可以再次洗涤蛋白质。

食谱

LB培养基
10g/L胰蛋白胨
5克/升酵母提取物
10g/L NaCl
LB-琼脂板
10g/L胰蛋白胨
5克/升酵母提取物
10g/L NaCl
1.5％琼脂
裂解缓冲液
500 mM NaCl
50mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）
5％甘油
0.2 mM EDTA
2mMβ-巯基乙醇
0.1％Tween-20
色谱缓冲液
100 mM NaCl
25mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）
5％甘油
考马斯亮蓝G-250缓冲液
无水乙醇47.5ml 100毫克磷酸邻（85％）
0.1 g G-250
将ddH ₂ O添加到1 L
SDS-PAGE染色溶液
300毫升乙醇无水乙腈 100 ml乙酸
1克亮蓝R-250
将ddH ₂ O添加到1 L
SDS-PAGE去污解决方案
300毫升乙醇无水乙腈 100 ml乙酸
将ddH ₂ O添加到1 L

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（31500218）的支持。

参考文献

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