材料和试剂

无菌接种环（Grenier Bio One，目录号：731170）
GeneMate 1.7 ml微量离心管（BioExpress，目录号：C-3260-1）
培养皿（94 x 16毫米）（Grenier Bio One，目录号：633161）
玻璃试管（18 x 150 mm）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：14-961-32）
0.22μm过滤器和注射器（用于牛磺胆酸溶液灭菌）（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229747）
0.45μm过滤器和注射器（用于D-果糖和L-半胱氨酸溶液的灭菌）（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229749）
感兴趣的艰难梭菌菌株，包括作为参照菌株或阳性对照的同基因亲本菌株（例如，630Δerm 或R20291），测试菌株，以及不能与母体（例如，，一个缺失突变体相同的同基因背景而不能发芽的阴性对照菌株[Heap等]/em>，2007; Dawson等人，2012; Deakin等人，2012; Fimlaid等人，2013; Mackin ，2013; Edwards等人，2014; Edwards等人，2016a]）
95％乙醇（190证明）（Decon Labs，目录号：2805SG）
无菌水
牛油胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：T4009）
脑心输注（BHI）（BD，目录号：237300）
酵母提取物（BD，目录号：212730）
固体介质琼脂（BD，目录号：214010）
Bacto蛋白胨（BD，目录号：211677）
蛋白胨（BD，目录号：211684）
Tris基（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP152）
硫酸铵[（NH 4）SO 4]（Sigma-Aldrich，目录号：A5132）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
氯化钠（NaCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP358）
氯化钾（KCl）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：P217）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S373）
磷酸二氢钾（KH 2 O 3 PO 4）（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：BP362）
D-果糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：L96）
10％（w/v）牛磺胆酸钠（见食谱）
预先还原的BHIS琼脂（补充酵母提取物的脑心脏输注;见食谱）
注意：使用前需要减少所有媒体。这是通过将板或液体培养基在使用前将板或液体培养基进入至少2小时至液体培养基的2小时或更长时间（参见Edwards等，2013）。
预先还原的BHIS琼脂补充0.1％牛磺胆酸盐
BHIS液体培养基（见食谱）
70:30孢子琼脂（每片一片;见食谱）
1x PBS（见食谱）
20％D-果糖（见食谱）
10％L-半胱氨酸（参见食谱）

设备

厌氧室（Coy A型或C型腔）
注意：除非另有说明，所有步骤均在厌氧室内进行。（Edwards et al。，2013）中描述了艰难梭菌培养的细节以及厌氧室的使用和维护。
分光光度计（Biochrom，型号：CO8000）
高压灭菌器

程序

接种含有0.1％牛磺胆酸和0.2％果糖的10ml BHIS培养基。将它们从板上放置并在37℃下孵育过夜。包括选择性抗生素，必要时进行质粒维护。
注意：有关基本的 C的其他详细信息。艰难梭菌种植，包括来自冷冻甘油储备的繁殖，参见Edwards等，2013。牛油胆酸是促进艰难梭菌菌落中存在的任何孢子的发芽的发芽剂。果糖是一种额外的碳源，可防止孢子形成并减少孢子在过夜培养中的积累。为了确保培养物在早上处于对数生长阶段，每个菌株的另外的过夜培养可以通过在接种到相同的培养基条件后将原始培养物1:200-1:1000反复稀释来进行。
早上，确保文化在中指数阶段积极生长，例如，，OD 600小于0.9。如果培养物经过OD 600 = 0.9，并因此进入转变或固定相，可能需要使稀释的培养物回到新鲜的BHIS中至OD 600， 0.5以允许培养物在开始实验之前超过并重新进入对数生长（约30-90分钟，取决于过夜培养物的原始密度）。如果培养物低于OD 600， 0.9，表示细胞处于对数生长期，继续步骤3.
允许培养物生长，或使用新鲜的BHIS将稀的后期指数期培养物（OD 600 <0.9）回升至最终的OD 600/0.5。在新鲜的预先还原的70:30孢子形琼脂的表面上加入250μl培养物，并用无菌接种环将其均匀地均匀地分散在表面上。将时间标记为H <0>，并在37℃下培养板24小时。
立即进行H <0>乙醇抗性孢子生成测定作为对照，以确保指数期培养物中不存在孢子。将0.5ml背面稀释（OD 600）= 0.5）培养物加入到含有0.3ml 95％乙醇和0.2ml dH 2 O的微量离心管中。涡旋好并孵育15分钟。将100μl每个H0.0％对照均匀地铺展到补充有0.1％牛磺胆酸琼脂平板的预还原BHIS上，并在37℃下孵育至少24小时。
注意：该对照确保从过夜培养物或之前的传代中没有显着数量的孢子携带，并确认孢子形成测定开始时尚未发生孢子形成，可能会错误地表示最终的孢子形成频率。/em>
在H 24上进行乙醇抗性孢子生成测定：
1. 枚举营养细胞
  1. 刮ape。使用无菌接种环从板的表面（板的大约1/8，取决于板表面上的细胞的密度），将细胞悬浮在约5ml BHIS中，以OD ₆₀₀ =约1.0。
  2. 在预还原的BHIS液体培养基中进行连续稀释的悬浮细胞，以列举营养细胞的总数。将100μl均匀分散在预还原的BHIS琼脂上。通常，将10μL/sup和10×sup-5稀释液各100μl电镀得到可计数的菌落。
2. 枚举孢子
计算孢子频率
1. 枚举所有板上的CFU>在37℃孵育24小时。分别计算营养细胞和孢子的总数，计算系列稀释度和平板稀释度。
  注意：请记住将乙醇抗性孢子乘以2，以考虑在乙醇暴露期间发生的二分之一稀释。另外，在H0平板上应该没有（> 100）至无CFU，并且spo0A突变体对照板上不存在CFU。如果超过500 CFU在H 0℃恢复，这可能会影响最终的孢子形成频率，并且在解释结果时要谨慎。最后，这个步骤可以通过有氧运动和数字殖民地计数器进行，以便于枚举。
2. 根据下列公式计算孢子频率

数据分析

以百分比（％）计算孢子形成频率，将最终数乘以100.所使用的统计分析将取决于测试的菌株数和条件。

笔记

除了使用乙醇抗性测定孢子频率之外，我们还鼓励使用第二种方法，如相差显微镜（Edwards等人，2014和2016b），以确认观察到的孢子形态表型。 br />
或者，该方案可以适于在液体培养物（例如，70:30液体培养基，BHIS液体培养基或TY液体培养基）中进行孢子形成测定。如果需要这些实验条件，请遵循Edwards等人，2014中概述的细节。简而言之，稀释指数期培养物（OD 600）= 0.5;来自步骤3）1:10进入预还原培养基（液体培养物的初始OD 600）将为约0.05）。使用分光光度计跟踪生长，直到培养物达到OD 600 = 1.00，其对应于大多数C的转变阶段的开始。艰难梭菌菌株。该时间点被表示为T 0> 0 。在T _{2 _{4 <（实现OD 600> 1.00之后2-4小时），将总细胞板（营养细胞和通过进行连续稀释并电镀到补充有0.1％牛磺胆酸的BHIS琼脂上，存在于培养物中。在T} 24时，使用0.5ml培养物进行如步骤5b.i中所述的乙醇抗性测定，并继续所述的方案。该方法提供了在T24亚型培养物中存在的乙醇抗性孢子与在T 24％峰值生长时的总细胞数（营养细胞和孢子）的比较，计算液体培养中的孢子形成频率。重要的是注意到在板上观察到比在液体培养基中更高和更一致的孢子频率（Fimlaid等人，2013; Edwards等人，2016b）。}

食谱

10％（w/v）牛磺胆酸钠
将1g牛磺胆酸溶解在10ml去离子水中。用0.22μm注射器过滤器灭菌，并在室温下储存
BHIS媒体
37 g/L脑心浸液
5克/升酵母提取物
15 g/L琼脂固体培养基
用去离子水冲洗至1升，121℃高压灭菌20分钟，以消毒对于补充有牛磺胆酸盐的BHIS琼脂，一旦培养基在高压灭菌后冷却至60-65℃，加入10％10％牛磺胆酸（终浓度为0.1％），注意：
1. 使用加温度计是监测介质温度的简单方法
2. 允许介质冷却另外20分钟（至约45-50℃），然后倒入板。将牛磺胆酸添加到比60℃以上的中等温度，消除了在牛磺胆酸（胆固醇衍生物）存在下可以在BHIS上生长的Mollicute物种的任何潜在污染物。这些污染物在琼脂的表面上显示为精确的菌落。
70:30孢子培养基
63 g/L Bacto蛋白胨
3.5 g/L蛋白胨蛋白胨
11.1 g/L脑心脏输液 1.5 g/L酵母提取物
1.06g/L Tris碱
0.7g/L硫酸铵[（NH 4）2 SO 4]
15 g/L琼脂固体培养基
用去离子水冲洗至1升，121℃高压灭菌20分钟即可灭菌。高压灭菌后，加入3 ml 10％（w/v）L-半胱氨酸（最终浓度，0.03％）注意：
1. 当注射板时，每个培养皿（94 x 16 mm）使用35 ml培养基，以确保每个培养皿之间的一致性。
2. 如果使用携带质粒的菌株，请使用2μg/ml的甲砜霉素进行维护。该浓度稳定地保持赋予甲砜霉素抗性的质粒，而不干扰含有对照载体的亲本菌株的孢子形成频率。最佳浓度可能需要经验确定其他抗生素。
1x PBS
8.01克/升NaCl
0.2克/升KCl
2.72g/L Na 2 HPO 4 7H 2 O O
0.27g/L KH 2 4
用去离子水送至1升，121℃高压灭菌20分钟，或使用0.45微米过滤器灭菌。
20％D-果糖
将10g D-果糖溶于50ml去离子水中。用0.45μm注射器过滤器灭菌，并在室温下储存
10％L-半胱氨酸
将0.5g L-半胱氨酸溶于5ml去离子水中。用0.45微米注射器过滤器灭菌。这种溶液沉淀，需要在每次使用前进行清新

致谢

这项工作得到美国国家卫生研究院（NIH）向SMM授予AI116933和AI109526的支持。该协议来自于Edwards等人，2016b。

参考文献

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