材料和试剂

18×18毫米方形显微镜盖（松本玻璃，目录号：C218181）
22 x 40毫米方形显微镜盖滑（松本玻璃，目录号：C022401）
双面胶带（NICHIBAN，NICETACK ^TM，目录号：NW-5）
修补胶带（3M，Scotch ^®，目录号：810-3-15）
滤纸 70（ADVANTEC，目录号：00021070）
1.5 ml微管
M。移动 163K株（ATCC，目录号：43663）
直径1.0μm的聚苯乙烯珠（Polybead<>羧酸盐微球1.00μm）（Polysciences，目录号：08226-15）
PolyLink Protein Coupling Kit for COOH Microspheres（Polysciences，catalog number：24350-1）

PolyLink耦合缓冲区
PolyLink EDAC

来自蛋清的抗生物素蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9275）
具有20mM葡萄糖的PBS（PBS/G）
具有40mM葡萄糖的PBS//
Sulfo-NHS-LC-LC-生物素（Ez-Link ^{Sulfo-NHS-LC-LC-生物素）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号： 21338）}}
葡萄糖
指甲油
心输液汤（BD，目录号：238400）
酵母提取物（BD，目录号：212750）
10 N NaOH
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：16050122）
两性霉素B（Sigma-Aldrich，目录号：A2942）
氨苄青霉素钠（Nacalai Tesque，目录号：02739-32）
磷酸钠（pH 7.3）
NaCl
Aluotto中等（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：Sigma 1-14）
25厘米组织培养瓶（AS ONE，目录号：2-8589-01）
25℃培养箱（东京Rikakikai，型号：LTI-400E）
超声波发生器（艾默生工业自动化，BRANSON，型号：2510J-MT）
光学显微镜（奥林巴斯，型号：IX71）
光学镊子系统（注1）
高速电荷耦合器件（DigiMo，型号：LRH2500XE-1）
功率计（激光功率/能量计）（相干型号：FieldMaxII-TOP，目录号：1098580）
高压灭菌器

软件

ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/index。 html ）
IGOR Pro 6.33J（WaveMetrics，Portland，OR）

程序

涂布聚苯乙烯珠与抗生物素蛋白
1. 温热聚苯乙烯珠，偶联缓冲液和PBS至室温（RT）
2. 在室温下将60μl聚苯乙烯珠悬浮液离心60分钟6分钟
3. 弃去上清液，将沉淀重悬于400μl偶联缓冲液中，并在室温下以2,000×g离心6分钟。
4. 弃去上清液，将沉淀重悬于160μl偶联缓冲液中
5. 使用前，将11.7mg EDAC溶于50μl偶联缓冲液中，加入20μl该溶液至悬浮液中，并在室温下孵育5 min。
6. 将0.4mg的抗生物素蛋白溶解在10μl偶联缓冲液中，为最终浓度为0.13mM，将抗生物素蛋白溶液加入到悬浮液中，并在室温下轻轻的端到端混合孵育3小时。
7. 在室温下以2,000×g离心悬浮液6分钟，弃去上清液并将沉淀重悬于450μlPBS中。重复此步骤五次。
8. 将悬浮液转移到新的微管，并将其储存在4°C直到使用（可以储存6个月）。
M的生物素化。移动细胞表面
1. 接种1ml冷冻原料的M。在25cm 2组织培养瓶中移动到10ml的Aluotto培养基中，并在25℃静态培养以达到0.06-0.08的600nm的光密度。 >
2. 通过在室温下以12,000xg离心收集9ml培养细胞4分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬在900μlPBS/G中，并以12,000xg离心> 4分钟（注2）。
3. 在使用之前，通过将0.3mg Sulfo-NHS-LC-LC-生物素溶解在1ml PBS/G中制备0.5mM的Sulfo-NHS-LC-LC-生物素溶液。
4. 丢弃步骤B2的上清液，将细胞沉淀（注2）重悬于300μl的Sulfo-NHS-LC-LC-生物素溶液中，并在室温下孵育细胞悬浮液15分钟（平冢等）。，2006）
5. 在室温下以12,000×g离心悬浮液4分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀（注2）重悬于300μlPBS/G中。重复此步骤三次。
使用光学镊子强制测量
1. 准备一个隧道室（5毫米内部宽度，18毫米长，60毫米壁厚）由两个盖玻璃从盒子和双面胶带组成（图1）。
  
  图1.隧道室 （步骤C1）
2. 用糖蛋白涂覆玻璃表面，将20μl10％马血清的PBS/G注入隧道室，并在室温下孵育15分钟（注3）。
3. 用10至20倍体积的PBS/G稀释生物素化细胞的悬浮液。
4. 通过流动40μlPBS/G清洗隧道室，将20μl稀释的细胞悬浮液注入隧道室，并在室温下孵育15分钟。
5. 要移除浮游细胞，将20μlPBS/G插入隧道室
6. 将PBS中的抗生物素蛋白包被的珠子加入到含有40mM葡萄糖的相同体积的PBS中，以将葡萄糖浓度调节至20mM。
7. 用PBS/G稀释珠悬浮液，以获得适当的珠密度（10-20珠/125.4×70.6μm视场）用于力测量。
8. 将40μl珠悬浮液转移到新的微管，并超声处理20秒。
9. 将超声波珠悬浮液注入隧道室，并用指甲油密封两端
10. 通过将胶带修补到装有光学镊子的倒置显微镜台上来设置和固定隧道室（图2）。
  
  图2.在显微镜平台上设置隧道室 （步骤C10）
11. 通过聚焦激光束将玻璃表面底部附近的浮珠捕获，开始以200帧/秒的速度记录珠子的运动，并通过抗生物素蛋白 - 生物素相互作用立即将珠粒附着在滑翔细胞的后端。细胞从光镊的陷阱中心拉出珠子，最后停止（视频1）。记录应在开始停止后至少30秒继续（注4）。录制后，关闭激光束。
12. 拆下隧道室和物镜，将激光束打开与步骤C11相同的功率，并测量通过使用功率计去除物镜实现的平行光的应用激光功率。 />
13. 跟踪来自光学镊子的陷阱中心的珠子移动，并使用ImageJ和IGOR Pro，如前所述（Tanaka等人），从珠粒和激光束的中心距离算出力。，2016）
  <！ - flashid2127v167开始 - >
  视频1.将小珠和附件捕获到滑翔单元格 （步骤C11）。激光束的聚焦点由红色圆圈表示，标记为"陷阱中心"。 5秒钟，流动的珠子从右侧流出并被束缚在梁上。在18秒时，通过舞台处理将滑翔单元移动到场中。在27秒时，将小珠附着在滑翔细胞上。电池拉动被困珠并从33秒停止到最后。
  
  <！ - flashid2127v167结束 - >

数据分析

珠粒定位的计算方法在Thompson等人描述。（2002）。

笔记

在Tanaka等人中描述了光学镊子的构造。（2016）。类似的系统也可商购（激光光学镊子 - 迷你型基本型/无快门，SIGMAKOKI，目录号：LMS-M1064-2000。OTM200光学镊子附件，THORLABS，目录号：OTM200）。
细胞沉淀悬浮液
推荐使用移液器超过100次起伏分离细胞。
马血清热处理
对于 M。移动生长和滑行，马血清应在56℃热处理30分钟灭活。
ImageJ v1.43u的可用数据大小限制在1 GB左右。电影的数据大小取决于录制时间，字段大小和帧速率。一个例子是180秒，4 x 4平方米，每秒200帧。

食谱

Aluotto中等
2.1％心脏输液肉汤
0.56％酵母提取物
0.035％10N NaOH
注意：将上述三种试剂作为混合物溶解，高压灭菌，冷却至37℃以下，并在洁净台上加入三种试剂。
10％马血清
0.025％两性霉素B
0.005％氨苄青霉素钠
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
75 mM磷酸钠（pH 7.3）
68 mM NaCl
使用过滤器或高压灭菌器灭菌

致谢

这项工作得到了创新区"协调超分子运动机械及其多样性"科学研究资助（Mi Miata的授予24117002）和科学研究援助（B）的支持。日本教育部，文化部，体育部，科学技术部（授予日本宫田市授予24390107）。

参考文献

Ashkin，A.，Dziedzic，JM，Bjorkholm，JE和Chu，S。（1986）。观察电介质颗粒的单光束梯度力光阱。选择设计11（5）：288.
平冢，Y.，Miyata，M.，Tada，T.和Uyeda，TQ（2006）。由细菌驱动的微电动机。 Proc Natl Acad Sci USA 103（37）：13618-13623。
Jarrell，KF和McBride，MJ（2008）。令人惊奇的多种方式原核细胞移动。 Nat Rev Microbiol 6（6）：466-476。
Miyata，M.，Ryu，WS and Berg，HC（2002）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11889087"target = "_blank">支原体移动滑行的力和速度。 J Bacteriol 184（7）：1827-1831。
Tanaka，A.，Nakane，D.，Mizutani，M.，Nishizaka，T。和Miyata，M。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/27353751"target ="_ blank">滑移细菌的定向结合，支原体移动，由分离力和结合寿命所示。 MBio 7（3）。
Thompson，RE，Larson，DR和Webb，WW（2002）。