材料和试剂

Whatman玻璃纤维滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1820021）
Spectrum Laboratories 12-14 kDa透析膜（Pacific Laboratory Products，目录号：132706）
新鲜收获的皮下猪脂肪组织，肝脏，皮肤，心脏组织和内脏脂肪（由Diamond Valley Pork捐赠[Laverton North，VIC，Australia]）
注意：立即使用的所有组织都保存在-20°C。
人体组织（来自圣文森特医院墨尔本人类研究伦理委员会[议定书52/03]）的完全同意的患者获得道德准则的患者
注意：立即使用的所有组织都保存在-20°C。
蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）
硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：31119）
70％乙醇（Sigma-Aldrich）
Spectrum Laboratories Spectra/Gel Absorbent（Pacific Laboratory Products，目录号：292600）
PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：10010023）
DNeasy血&组织试剂盒（QIAGEN，目录号：69504）
Pierce ^TM BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：23225）}
Dulbecco改良的Eagle培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D5796）
胎牛血清（CSL，澳大利亚）
抗生素
油红O（Sigma-Aldrich，目录号：O0625）
苏木精
胶原酶I
4％多聚甲醛或10％中性缓冲福尔马林
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：798681）
N-马来酰亚胺（NEM）（Sigma-Aldrich，目录号：E3876）
盐酸苄脒盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：B6506）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U1250）
胍盐酸盐（GuHCl）（Sigma-Aldrich，目录号：50950）
冰醋酸（Sigma-Aldrich）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：RDD008）
NaCl
DNase I（Roche Diagnostics，目录号：11284932001）
RNase A（Roche Diagnostics，RNASEA-RO）
MgCl 2
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251）
氯仿（Sigma-Aldrich）
甲醇（Sigma-Aldrich）
Pepsin（Worthington Biochemical，目录号：LS003317）
解决方案（根据食谱概述的方向准备）

0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）
50mg/ml N，N-乙基马来酰亚胺（NEM）
50毫克/毫升盐酸哒嗪盐酸盐
8 M尿素
8 M盐酸胍（GuHCl）
0.5 N乙酸
4 M GuHCl提取缓冲液
10倍Tris缓冲盐水（TBS）
核酸酶溶液
1,000x血红蛋白沉淀溶液
氯仿 - 甲醇脂质提取液
10x蛋白酶抑制剂
0.75％胃蛋白酶

设备

刀或手术刀
平衡
4升烧杯
旋转搅拌机
震动孵化器
离心机（能够达到15,000 x g 的速度）
食品加工机，浸入式搅拌机或高容量组织均质机
粗棉布或细网纱布
5％CO 2加湿的37℃培养箱（用于体外试验）
通风柜

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/）
GraphPad Prism 6（GraphPad Software，Inc.）

程序

解剖
使用锋利的刀或手术刀，将冷冻的组织刮成2-3毫米厚的块，称重。冷冻组织有两个目的 - 裂解细胞，使切片更容易。也可以使用新鲜收获的组织，但必须注意保持组织冷。水凝胶的最终产量将是正在加工的组织体积的1-3倍。
注意：
1. 新鲜收集的组织，无论是动物还是人类，可以立即加工或储存在-20°C至-80°C，以便在加工前长时间储存。请注意，长时间储存（> 6个月）的组织会导致效果降低的水凝胶。
2. 为了方便起见，以下步骤中的组织的重量被称为一（1x）体积。
萃取
1. 将切片的组织转移到密封的容器中，并加入4M盐酸胍（GuHCl）提取缓冲液的至少2x体积（基于组织的重量）。在4℃下轻轻混合16-48小时以允许完全提取组织。
  注意：使用的GuHCl提取缓冲液的体积取决于正在处理的组织;具有高水平可提取蛋白质的组织将需要更大的体积。根据需要调整GuHCl的体积。通常，如果得到的蛋白质提取物是高度粘稠的，加入额外体积的提取缓冲液并孵育另外16小时用于进一步提取 - 非常高的胶原蛋白如皮肤和腱组织将具有比其他组织更少量的可提取蛋白质如肌肉和软器官如肝脏。理想情况下，采用旋转混合器，以端到端的方式进行提取步骤，以确保组织在孵育期间适当混合。也可以使用替代的混合器，只要它们在提取期间导致组织的充分运动。不推荐使用磁力搅拌器。
2. 至少16小时后，收集含有从组织提取的可溶性蛋白质的4M GuHCl，并通过玻璃纤维滤纸过滤以除去颗粒物质。
  注意：如果4 M GuHCl蛋白质提取物不容易通过玻璃纤维滤纸，用4 M GuHCl稀释，然后重试。
3. 在4℃下将蛋白质提取物与总共100倍体积的水进行透析。
  a。将4M GuHCl蛋白质提取物倒入合适长度的透析管中，确保不要将管道填充超过70％以允许在透析期间膨胀。
  b。将含有蛋白质提取物的透析管转移到预冷却的4L水中，并在4℃下混合。
  c。每1-2小时更换一次水，直到总共使用约100倍体积的水进行透析（透析可能会留置过夜）。
4. 取剩余的提取物，在4℃下轻轻混合（每10分钟更换一次），在水中洗涤1小时。一旦清洗，开始处理这个组织，如下一节所述 - 组织处理。
  注意：完成步骤B2-B4后，您将有两个样品 - 含有提取蛋白质的液体GuHCl部分和提取的组织的剩余部分。根据步骤B5-B8中概述的说明书处理液体馏分;根据步骤C - 组织处理处理固体组织。
5. 在水中透析后，测量GuHCl提取物的体积。加入1μl0.5M硫酸锌（ZnSO 4）（1,000x储备）/ml GuHCl提取物，开始沉淀血红蛋白（Hover和Kulkarni，2000）。简单混合，然后在4℃温育蛋白质提取物30分钟，然后在4℃下以15,000xg离心15分钟。
6. 将上清液转移到干净的容器中并加入蛋白酶抑制剂（1mM的N-乙基马来酰亚胺，苯甲脒和EDTA）。将提取物转移到透析膜上，并在4℃的水中透析过夜以除去过量的ZnSO 4。
  1. 将提取物倒入适当长度的透析管，确保不要将管道填充超过70％以允许在透析期间膨胀。
  2. 将含有蛋白质提取物的透析管转移到预冷却的4L烧杯中，并在4℃下混合。
  3. 每1-2小时更换一次水，直到总共使用〜100倍体积的水进行透析（透析可能会留置过夜）。
  注意：ZnSO 4的最终工作浓度为0.5mM。如果没有明显的血红蛋白污染，即蛋白质提取物的颜色很少，可以跳过步骤B5-B6。
7. 透析后，测量蛋白质提取物的体积，并转移到烧杯中，容量至少为提取物体积的两倍。在冰上搅拌提取物时，缓慢溶解0.5ml硫酸铵/ml组织提取物（Doonan，1996）。一旦硫酸铵完全溶解，使蛋白质在4℃下沉淀至少1小时，或优选过夜
8. 一旦沉淀，通过在4℃以15,000×g离心20分钟收集蛋白质。弃去上清液并将蛋白质颗粒溶解在水中。使用尽可能少的水来完全溶解蛋白质。储存于-20°C直至步骤D（最终处理）。
  注意：沉淀中存在的残留硫酸铵将有助于溶解蛋白质。尽管存储的提取物长达12个月已被证明保留了很多功效，但最好在使用前限制储存时间。
组织加工
1. 在水中洗涤GuHCl提取的组织片后，重新称重组织，然后转移到大容器中，并在过量体积的冷冻水（> 20倍体积）中均质化。
  注意：高容量组织匀浆器很难找到;可以使用市售食品加工商或浸没式搅拌机。如果正在处理脂肪组织，重要的是彻底均匀组织以从组织释放脂质。重要的是，该步骤中使用的水被冷却，使得组织中存在的任何脂质变得固体。
2. 使用镊子，取出少量的纸巾，在单独的烧杯中彻底冲洗，并转移到冰上的干净的容器（图1）。重复此过程，直到所有的组织都被收集。在这个阶段，如果您正在使用脂肪组织 - 在冷冻水中均质化并根据需要重复，直到所有可见的脂质被去除，可能需要重复此过程。
  
  图1.清洁均质组织的步骤
3. 一旦洗涤，将纸巾干净吸干纸，并测量重量 - 这是1x体积。
4. 准备1.5倍体积的核酸酶缓冲液。将组织和核酸酶缓冲液转移到密封容器中，并在37℃下轻轻混合至少1小时。
5. 消化后，弃去核酸酶缓冲液，并在室温下将水洗三次。
6. 弃去水并加入至少10倍体积的70％乙醇。在37℃下混合至少15分钟。丢弃乙醇，然后在室温下用水洗涤组织三次。
7. 对于脂肪或类似的脂肪组织，可以在此阶段使用Folch脂质提取方法以进一步除去任何残留的脂质（Folch等人，1957）。准备10-20倍体积的2：1（氯仿：甲醇），并在室温下在通风橱中与组织混合20分钟。相应地丢弃液体废物，然后用过量的水彻底洗涤组织三次或更多次。将纸巾与吸收纸干燥并测量重量 - 这是1x体积。
8. 在0.5M乙酸中制备2倍体积的0.75％胃蛋白酶。在室温下混合直到完全溶解。用过量体积的0.5M乙酸短暂洗涤组织（30秒）以预先膨胀组织。弃去乙酸，将组织转移到气密容器中，加入胃蛋白酶。在室温下剧烈混合，直到组织消化（≥2天 - 定期检查摘要）。确保在室温下孵育组织;不要37℃，不要长于需要消化组织。消化的组织应相对清澈，相当粘稠。
  注意：或者，可以在加入溶解的胃蛋白酶之前，用等体积的0.5M乙酸将组织匀浆。这将大大缩短所需的消化时间，但最终产品在使用前可能需要浓缩。根据正在消化的组织，可能需要加入额外的胃蛋白酶。胶原蛋白如皮肤和肌腱组织非常高，可能需要添加更多的胃蛋白酶才能完全消化（Neuman et al。，1950）。 24小时后，如果消化物特别粘稠，可以加入另外0.75％的胃蛋白酶，直到组织能够容易地混合。必须注意，只有添加最少量的胃蛋白酶才能降低免疫原性反应的可能性（Northrop，1930; Samuels et al。，2009; Seastone et al。，1937）。混合直至消化。
9. 一旦消化，通过挤压通过粗棉布，细网纱或等效物去除任何颗粒物。按照15,000 x g，4℃，20分钟离心分离。小心地清除表面上的任何可见的脂质，并将消化的蛋白质转移到透析膜上。在4℃下对100x体积的冷冻TBS进行透析16-48小时以中和胃蛋白酶。
  注意：使用刮刀从干酪布中收集所有消化的蛋白质。如果不小心，很多蛋白质在这个阶段可能会丢失
最后处理
1. 将液体蛋白质提取物从-20°C储存并解冻。将所有液体提取物加入到中和的胃蛋白酶消化物中并充分混合。将混合物转移到透析膜上并开始灭菌。在这个阶段，Spectra/Gel Absorbent可以在4℃下使用，以增加灭菌前的凝胶浓度（遵照制造商的说明）。
2. 在冷冻的8M尿素（Roberts and Lloyd，2007）中透析在4℃下过夜灭菌凝胶，然后在4℃在冷却的0.5％氯仿/TBS中透析过夜。
  注意：在8M尿素透析后，所有蛋白质应彻底溶解并浓缩。
3. 最后，对100x体积的冷冻TBS透析16小时，并完成对100倍体积的冷冻PBS透析16小时。在-20°C至-80°C下保存凝胶等分试样。水凝胶的工作等分试样应在4℃下缓慢解冻。解冻的水凝胶可以在4℃下储存1个月，不会有任何的功效丧失。取决于所需的浓度，最终产量应在组织起始体积的1-3倍之间。在进行体外测试之前，应测定最终产品的样品中的DNA（QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit）和蛋白质浓度（Pierce ^TM BCA Protein Assay Kit）。凝胶应在37℃下10分钟内进行。如果需要，可以使用无菌PBS调节最终的蛋白质浓度注意：蛋白质浓度>建议使用3mg/ml以维持凝胶化后的水凝胶的完整性，然而凝胶化将在浓度为1mg/ml时发生。

数据分析

测试和分析水凝胶的方式完全由研究者决定，然而用于测试的细胞类型，重复次数和使用的细胞总数应足以产生有意义的一致结果。下面描述的脂肪来源的水凝胶测试的一般程序可以适用于其他类型的组织衍生的水凝胶的测试。
以下部分扩展和补充了我们以前的文章中描述的分析脂肪来源水凝胶的脂肪生成活性的分析（Poon等人，2013）;建议读者参考该出版物的实验方法和进一步的细节。
脂肪形成水凝胶的体外测试通常使用在补充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养的脂肪来源的干细胞（ADSC）来进行。然后将细胞补充有脂肪形成组分的混合物（Zuk等人，2001）或与水凝胶测试材料。在约两周的时间之后，在固定之前将水凝胶从培养皿中取出，并用油红O（90分钟）和苏木精（3分钟）染色。在水凝胶难以除去的情况下，用胶原酶I（2mg/ml）进行短消化有助于分离凝胶。从培养皿中彻底清除所有痕量的水凝胶后，将细胞固定在甲醛（4％多聚甲醛或10％中性缓冲福尔马林）中，用油红O /苏木精染色，然后定量。注意：在细胞接种之前，水凝胶可以预先设置在组织培养皿的一个边缘上 - 将一定体积的水凝胶移至培养皿中，并在37℃以45度角孵育直到凝胶完全凝固（〜10分钟）。
使用免费提供的软件ImageJ（）进行原始出版物中的分化细胞的定量https://imagej.nih.gov/ij/）（Rasband，1997-2016; Abramoff等人，2004）。
如果组织培养孔足够小，或者您的摄影设备有效，建议采用整个培养面的单一高分辨率图像;否则应为每个组织培养井拍摄多个随机选择的场。
每个图像在ImageJ中打开并分析如下：

在ImageJ中打开图像。
选择插件→分析→网格。为网格线选择合适的颜色，然后选择OK（图2）。

图2.打开网格线
选择插件→分析→单元格计数器（图3）。

图3.选择单元格计数器
在出现的单元格计数器窗口中，选择"初始化"，然后选择8个计数器之一。每个计数器都有不同的颜色（图4）

图4.单元格计数器窗口
首先点击所有苏木精染色的细胞以获得总细胞数，运行的计数将出现在计数器号旁边的窗口中。现在选择另一个计数器，然后点击所有的油红O染色细胞。
完成计数后，从窗口中选择保存标记以保存结果。
油红O染色细胞的比例可以从这两个数字确定。

在对从体外分析获得的所有图像进行定量后，可以生成一张图表以进行分析。表1中显示的数字是我们以前的出版物（Poon等人，2013年）的定量结果。使用GraphPad Prism 6（GraphPad Software，Inc。）进行单因素方差分析与事后Tukey多重比较检验的统计分析，以比较每个测试条件的成脂活性。

表1.脂肪细胞定量人ADSCs补充有脂肪生成培养基（Zuk），脂肪来源的水凝胶（Gel）或脂肪生成培养基和脂肪来源的水凝胶（Gel + Zuk），然后用油红O和苏木精，定量。

体外分析的最终结果示于下表2和图5中。这个数字的一个版本以前提出（Poon等人，2013）。

表2.通过单因素统计分析的总结ANOVA与事后Tukey的多重比较测试

图5.脂肪来源的水凝胶与Zuk的脂肪形成培养基对人脂肪干细胞的脂肪生成活性。数据显示SD的平均值。统计学分析方法ANOVA显示脂肪生成活性的统计学显着增加，当Zuk的脂肪生成培养基补充脂肪来源的水凝胶（*）。以前描述了这种分析（Poon等人，2013）。

对于脂肪来源的水凝胶，我们观察到脂肪生成活性的一批间批次变化。负责这个的变量是未知的，但年龄似乎是一个重要因素。如果可能，建议在大规模生产之前筛选多个组织来源的脂肪样品用于脂肪生成活性。通过在标准组织培养条件下将十倍体积的完全培养基中的脂肪温育24小时，可以从组织样品产生条件培养基。一旦过滤灭菌，可以测试条件培养基对ADSC的脂肪生成活性。通过该筛选方法测定的最成脂组织可用于水凝胶生产。

食谱

0.5M乙二胺四乙酸（EDTA）（250ml）
36.53克EDTA
将pH调节至8
加入双蒸水至250 ml
50mg/ml N，N-乙基马来酰亚胺（NEM）（2.5M; 10ml）
0.5克NEM
乙醇至10 ml
50mg/ml苄脒盐酸盐水合物（3.13M; 1ml）
50毫克苯甲脒盐酸盐加入双蒸水至1 ml
8 M尿素（1升）
480.48克尿素
加入双蒸水至1升过滤玻璃纤维滤纸
8M盐酸胍（GuHCl）（1L）
764.32 g的GuHCl
加入双蒸水至1升过滤玻璃纤维滤纸
0.5 N乙酸（1升）
971.2ml双蒸水
28.8ml冰醋酸
4M GuHCl提取缓冲液（50mM Tris-HCl pH7.4; 4M GuHCl; 100ml） 5毫升1M Tris-HCl pH7.4
50ml 8M GuHCl
加入双蒸水至100ml
10倍Tris缓冲盐水（TBS）（0.5M Tris-HCl; 1.5M NaCl; 1L） 60.57克Tris
87.66克NaCl
将pH调节至7.4
加入双蒸水至1升过滤玻璃纤维滤纸
核酸酶溶液（50μg/ml DNA酶I;10μg/ml核糖核酸酶A; 10mM MgCl 2; 10 ml）
50μl10 mg/ml DNase I
10μl10 mg/ml RNase A
100μl1M MgCl 2
PBS至10 ml
1,000x血红蛋白沉淀溶液（0.5M ZnSO 4·50ml）
7.2g ZnSO 4·7H 2 O
加入双蒸水至50 ml
氯仿 - 甲醇脂质提取溶液（[2:1]氯仿：甲醇; 150ml） 100ml氯仿
50ml甲醇
10倍蛋白酶抑制剂（10mM EDTA pH8; 10mM N，N-乙基马来酰亚胺; 10mM苄脒; 100毫升）
2 ml 0.5 M EDTA pH 8
400μl50 mg/ml NEM
319μl50 mg/ml盐酸苯甲脒
加入双蒸水至100ml
0.75％胃蛋白酶（7.5mg/ml胃蛋白酶; 50ml）
375毫克胃蛋白酶
0.5 M乙酸至50 ml

致谢

我们感谢Kiryu K. Yap博士（圣文森特研究所和墨尔本大学外科系）对稿件的编辑帮助。维多利亚州政府OIS计划和国家卫生和医学研究委员会项目拨款1064786支持这项工作。

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