材料和试剂

无菌塑料容器
0.45μm无菌瓶顶过滤器（Corning，目录号：430514）
铝箔
50ml无菌离心管（VWR，目录号：89039-656）
15 ml无菌离心管（VWR，目录号：89039-664）
100％N 2
0.1％（m/v）焦磷酸钠（EMD Millipore，目录号：SX0741）
0.1M硫酸（H 2 SO 4 SO 4）
0.2N氢氧化钠（NaOH）
FeSO 4·7H 2 O（VWR，目录号：97061-538）
1克/升铁（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：AC410570050）
50mM HEPES（pH = 7.0）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
羟胺-HCl（VWR，BDH ，目录号：BDH9236-500G）
Bio-Rad蛋白测定试剂盒II（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000002）
10％（w/v）草酸（VWR，BDH ，目录号：BDH7336-1）

设备

重型圆形瓶（VWR，目录号：10755-104）
标准磁力搅拌器
发酵罐（Eppendorf，Brunswick ^TM，型号：BioFlo /Celligen ^® 115）
pH计
板式离心机
高压灭菌器
冰箱
分光光度计

软件

发酵罐自动控制软件Eppendorf BioFlo ^®/Celligen ^®
Adobe ^® Photoshop ^®软件

程序

沿着缺氧的富含Fe（II）的自流式AMD流动路径从池底部采集沉积物。沉积物被收集在自发放电的下游，其中AMD已经充分充气（图1A）。通过仔细切割并从流床的顶部2厘米处撬出完整的碎片来收集沉积物（图1B）。将这些样品保存在用盖子封闭的无菌塑料容器中，用干冰运输到实验室，并在使用前不要超过一周储存在4°C冰箱中。
收集水用于微生物富集（图1C）。水从缺氧自流弹簧收集到酸洗的塑料容器中（完全充满少量或没有顶部空间）。使用范围从12-40升的聚丙烯碳水化合物将水输送到实验室。在实验室抵达实验室后，将所有的水都过滤（0.45μm无菌瓶顶过滤器）放入塑料容器中，用N 2膜吹扫，裹上铝箔，并在4℃下储存。水在使用前不得超过一周。

图1.典型的富含Fe（II）的自流体AMD站点（A），沉积物收集（B）和集水（C）的照片
为了培养富集培养物，将100g潮湿沉淀物与无菌瓶中的1L 0.1％（m/v）焦磷酸钠（用硫酸调节至天然AMD水的pH）混合（图2A）。
30分钟后，将该混合物在磁力搅拌器上以400rpm搅拌，从沉淀物中分离出细胞。
使悬浮液沉降30分钟，然后将900ml含细胞的上清液倒入无菌的3L恒化器反应器容器中（Eppendorf BioFlo/sup/115发酵罐）（图2B）。反应器容器能够适应低pH值（2

图2.在无菌恒化器反应器容器中富集天然沉积物微生物的照片。 A.细胞分离步骤; B.生物反应器容器C.使用生物反应器。
通过加入过滤的（0.45-μm）部位的AMD水（图2C），将恒化器反应器容器中的液体体积增加到2L。
恒化器然后在无流量，补料分批模式下操作4至6周。生物反应器的自动控制组件保持恒定的pH，温度和混合速度，并连续记录溶解氧。使用反应器中的pH计和两个递送0.1MH 2 SO 4或0.2N NaOH的蠕动泵之间的反馈控制来保持任何所需的pH设定点（图3）。使用反应器内的单程自来水进料冷却盘管和反应器周围的热套管来维持反应器温度。空气被连续地泵送到反应器容器的底部以确保无限的溶解氧。在浓缩期间，恒化器的pH设定点与现场水相同，搅拌速度为50rpm，温度为20℃，溶解氧不受限制（例如<！ - SIPO

图3.包括反馈系统，蠕动泵和搅拌器的生物反应器系统的照片
将硫酸亚铁（FeSO 4·7H 2 O）不连续地加入到反应器中作为主要底物以富集自养Fe（II）氧化微生物。加入硫酸亚铁，得到溶解的[Fe（II）] 300mg L ^{1，当溶解的[Fe（II）]降低到低于30mg L -1时，。}
在Fe（II）氧化和总Fe去除率达到假稳态条件（±5％标准偏差）之后，含有丰富的Fe（II） - 氧化微生物群落的生物膜明显均匀地附着在反应器壁上2C）。不到一个月，富集培养物需要每日剂量的Fe（II），因为微生物以快速的速率氧化Fe（II）。
抽样
1. 使用无菌移液管在反应器容器内的液面顶部收集Fe（II）测量样品。用螺丝盖封闭的容器顶部的未使用的口可打开以取样。每次对Fe（II）和总Fe测量每次收集2ml水。用0.1N HCl（Stookey）保存的样品，使用铁氰化物测定（50mM HEPES [pH7.0]中的1g/L铁锌）测定溶解的Fe（II）和溶解的总Fe（T）（通过羟胺-HCl还原后），1970）。取样频率取决于Fe（II）氧化速率。生物反应器必须在头两个星期每天进行采样，而不是经常采样。
2. 从反应器壁收集生物膜样品，并从悬浮液中收集水样品以确定生物质浓度。打开反应器容器的盖子，将水倒入无菌容器中。在使用无菌移液管从反应器壁上刮下生物膜后，将水倒入反应容器中，盖上盖子。基于蛋白质（使用考马斯亮蓝G-250染料的Bio-Rad蛋白质测定试剂盒）测定生物质浓度。将至少1cm 2的生物膜的区域从反应器的壁上刮下来用于蛋白质测定。标尺用作参考物质（图4）。刮刮区域的照片与Adobe ^® Photoshop ^®软件一起使用，以确定每次删除的确切区域。
  
  图4.使用标尺作为面积计算的参考物质的刮片生物膜的示例性照片
3. 将收集的生物膜溶于3ml 10％（w/v）草酸中。一旦溶解，通过将1ml该混合物与2ml 0.2N NaOH一起溶解，然后在-20℃冷冻器中对样品进行两次冷冻 - 融化循环至少6小时和37℃水洗澡约10-15分钟。然后使用含裂解细胞的混合物进行蛋白质比色测定。
4. 对于悬浮液，将135ml反应器液体离心（13,000×g 10分钟）以造粒细胞。测量用于离心的Falcon ^®管的质量，以确定每个颗粒的质量。然后将液体倾析，细胞沉淀物与上述刮除细胞完全一致。

数据分析

假设恒化器作为完全混合的反应器运行，Fe（II）氧化[mol Fe（II）L ^{-1 ^{sec ^{-1]的零级速率在恒电位计算如下：

哪里，
d [Fe（II）]降低溶解的Fe（II）浓度（mol L ^-1），
dt是培养时间的增加}}}
对于浓缩实验，该系统相对于Fe（II）氧化速率达到假稳态。为了将伪稳定状态下的某些测量点和其他测量点不相等，计算最后一次测量的正负5％标准偏差范围。任何落在正或负5％标准偏差范围内的任何点都被认为处于伪稳态。这个统计方法强调了最后一个测量点，因为所有其他点都与它进行比较。
为了确定悬浮液和生物膜中细胞的浓度，使用Bio-Rad蛋白测定试剂盒。一旦获得了蛋白质浓度，则使用衍生的0.15×10 12个蛋白质/典型细胞的转化因子将存在的蛋白质质量转换成细胞数量。

笔记

由于富含Fe（II）的氧化微生物群落受pH和Fe（II）浓度的影响很大（Sheng等人，2016），pH设定点和Fe（II）浓度恒温器可以根据现场AMD的pH和Fe（II）浓度进行调整。
收集沉淀物和水以进行微生物富集。沿着缺氧的富含Fe（II）的自流式AMD流动路径从池底部采集沉积物。水从无氧自流泉收集。为了开发浓缩培养物，将100克潮湿的沉淀物与1升0.1％（m/v）焦磷酸钠（用硫酸调节至天然AMD水的pH）混合。
Chemostat生物反应器在现场AMD的pH值，温度20℃，搅拌速率50rpm和无限溶解氧（> 3mg/L）下操作4-6周。
Ferrozine测定（1μg/L铁锰在50mM HEPES [pH7.0]中）用于测量Fe（II）氧化速率（Stookey，1970）。
将附生生长和悬浮的生物质溶解在10％（w/v）草酸中，与0.2N NaOH混合，然后进行两次冻融循环以裂解细胞。基于蛋白质（使用考马斯亮蓝色G-250染料的Bio-Rad蛋白质测定试剂盒）确定生物质浓度。

食谱

Ferrozine测定溶液（pH 7.0）
1克/升铁锌素 50 mM HEPES
嗜酸细菌的丰富
将100克潮湿的沉淀物与1升0.1％（m/v）焦磷酸钠混合用硫酸调节天然AMD水的pH值

致谢

该协议由Sheng等人改编。（2016）。这项工作得到了美国中国学术委员会（以Y.S.）和阿巴拉契亚环境科学研究计划（ARIES）合作协议S11AC20005的地表采矿开垦和执法办公室的部分支持。 ARIES是弗吉尼亚理工学院的一个工业附属计划，由包括能源部门公司在内的成员支持。本文所表达的意见和建议只是作者的意见和建议，并不意味着ARIES的任何认可。

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