材料和试剂

Scalpel（Swann Morton，目录号：0208）
注射器，1 ml（BD，目录号：300013）
15毫升锥形底部聚丙烯管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
5ml移液器
针（27 G）
小鼠（4-6周龄，体重超过20g，英国Charles Liver）
异氟烷（Abott，目录号：0044-5260-05）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
PKH26试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：PKH26GL-1KT）
氯化钠，NaCl（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10378573）
氯化钾，KCl（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10427460）
磷酸二氢钠一水合物，NaH 2 PO 4 H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：S9638）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15023021）
氯化镁，MgCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
柠檬酸三钠（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：10362234）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
右旋糖（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：D16-1）
前列腺素E1（Sigma-Aldrich，目录号：P5515）
100％乙醇
碳酸氢钠，NaHCO 3（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S637-212）
蒸馏水
牛血清白蛋白，BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
碳酸氢钠，Na 2 HPO 4（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S374）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：71498）
修改Tyrode的无钙缓冲液（见配方）
ACD缓冲（见配方）
未稀释的前列腺素E1溶液
再悬浮缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（见配方）
柠檬酸 - 白蛋白缓冲液（参见食谱）

设备

库尔特计数器（CDC Technology，型号：HEMAVET ^® 1500）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Jouan CR4i）

程序

血小板分离
1. 通过吸入异氟烷（2.5％，医用级别的氧气）将小鼠置于终端麻醉下。
2. 用手术刀打开腹部，将肠子推开，露出主要的腹部血管。
3. 将含有ACD缓冲液（150μl/ml血液）的针头（27G）的注射器插入肾静脉上方的腔静脉以收集血液（图1）。以这种方式收集的血容量对于20.0g重量的小鼠通常为800-1,000μl。收集血液后，小鼠通过切断腔静脉完全放血。
  
  图1.小鼠中腔静脉的血液收集。 A显示腔静脉的位置，B显示采用含有ACD缓冲液的注射器采集血液。
4. 血液应在收集过程中通过与ACD缓冲液快速混合来抗凝。然后将血液转移到15ml锥形底部聚丙烯管中，并与洗涤缓冲液（3ml/ml，1ml 100mmol/L EGTA [pH6.8]和2ml再悬浮缓冲液）混合。
5. 将管在180℃下以22℃离心10分钟。这导致较大的细胞元素如红细胞和白细胞的沉淀
6. 收集富含血小板的血浆并转移到15ml锥形底部聚丙烯管中。弃粒。加入步骤A4中详述的洗涤缓冲液，加入前列腺素E1（0.25μmol/L），得到总体积为10ml。将混合物用5ml移液管轻轻移液3-5次。在这一点上，前列腺素是必不可少的，以防止血小板活化。
7. 将管以1,250×g×22℃离心10分钟
8. 丸粒现在主要由血小板组成。取出上清液，再用步骤A6中的缓冲液用前列腺素洗涤两次，如步骤A7所示离心。
9. 此后在10ml洗涤缓冲液（包括0.25μmol/L前列腺素E1）中悬浮后，可以计数血小板。
10. 计数血小板，混合血小板悬浮液（15μl）和未稀释的前列腺素E1（5μl，500μM）。可以在库尔特柜台进行计数。请注意，必须根据小鼠血小板的大小调整计数器。小鼠血小板的直径约为0.5μm，小于人血小板（1-2μm）。
11. 此时血小板可用于实验记忆，直到开始实验，重要的是用0.25μmol/L前列腺素E1阻断活化。这样就需要通过稀释来去除血小板作用。
血小板染色
1. 我们使用重要的染料PKH26按照制造商的指示对收集的血小板进行荧光标记，并进行了一些修改。在这一点上，来自步骤A9的血小板可以如A7那样离心。应将其悬浮于1ml稀释剂C（PKH26试剂盒）中，加入加入0.25μmol/L前列腺素E1的8×10 5 /μl/μl。
2. 通过将PKH26染料溶液稀释在100％乙醇中制备PKH26（1mM）的储备溶液
3. 将2μlPKH26和前列腺素E1（2.5μg/ml）加入1ml血小板悬浮液中。
4. 通过轻轻移液器立即混合样品。
5. 在22℃下孵育样品10分钟
6. 通过加入10ml柠檬酸盐 - 白蛋白缓冲液，0.35％牛血清白蛋白（pH6.5）和0.25μmol/L前列腺素E1的混合物来终止染色反应。
7. 将混合物在22℃下孵育1分钟。
8. 通过在22℃下以1,250×g离心20分钟来造粒血小板。
9. 取出上清液，并将重悬浮缓冲液中的6×10 6 /μl的血小板重新悬浮使用（如方案4所述）。
10. 对于体内实验，可以将100μl血小板悬浮液注入1ml注射器针（27G）到小鼠尾静脉中。
11. 我们发现，从5只小鼠以这种方式收获的血小板数目通常足以在3只小鼠体内注射。所得的重组通常导致约50％的血小板被新引入和荧光。它们保持功能至少24小时。在那段时间之后，我们还没有详细说明，但是原则上应该有更长的时间跨度。

数据分析

数据分析的细节在Im等人的文章中给出。（2004）和Gil-Bernabe等人。（2012）。

笔记

PGE1必须在每次使用缓冲液时新鲜加入，不能储存。手术中最可变的部分是静脉注射血小板。

食谱

改良的Tyrode的无钙缓冲液（pH 7.2）
134 mmol/L NaCl
3 mmol/L KCl
0.3mmol/L NaH 2 PO 4 H 2 O 2//O 2 5 mmol/L HEPES
5 mmol/L葡萄糖
2mmol/L MgCl 2
用HCl（36.5％-38％）调节pH至7.2
ACD缓冲液（150μl/ml血液，pH 4.5） 85 mmol/L柠檬酸三钠
71 mmol/L柠檬酸 111 mmol/L葡萄糖
注意：溶液的pH值约为4.5，因此不需要调节。
未稀释的前列腺素E1溶液
50μmol前列腺素E1/100ml乙醇
再悬浮缓冲液
100ml 7.5％NaHCO 3
133毫升蒸馏水
300毫克牛血清白蛋白
15毫升改良的Tyrode无钙缓冲液
洗涤缓冲液
1ml 100mmol/L EGTA（pH6.8）
2 ml再悬浮缓冲液
柠檬酸 - 白蛋白缓冲液（pH6.5）
11 mmol/L葡萄糖 128 mmol/L NaCl
4.3 mmol/L NaH 2 PO 4 H 2 O 2// 7.5 mmol/L Na 2 HPO 4
4.8 mmol/L柠檬酸钠 2.4 mmol/L柠檬酸
0.35％（w/v）牛血清白蛋白用HCl调节pH至6.5（36.5％-38％）

致谢

作者得到NIH授权R01 CA89188，R01 CA46830的支持，目前由英国癌症研究所资助。该协议是由Im等人的文章改编而成。（2004）。

参考文献

Gil-Bernabe，AM，Ferjancic，S.，Tlalka，M.，Zhao，L.，Allen，PD，Im，JH，Watson，K.，Hill，SA，Amirkhosravi，A.，Francis，JL，Pollard，JW ，Ruf，W.和Muschel，RJ（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22327225"target ="_ blank" >通过组织因子介导的凝血对单核细胞/巨噬细胞的募集对小鼠的转移性细胞存活和转移前的小生境建立至关重要。血液 119（13）：3164-3175。
Im，JH，Fu，W.，Wang，H.，Bhatia，SK，Hammer，DA，Kowalska，MA和Muschel，RJ（2004）。凝血促进早期转移性集落形成期间肺血管中的肿瘤细胞扩散。癌症研究 64 （23）：8613-8619。
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