材料和试剂

防护手套（Medicom，目录号：1174D）
保护外套（Medicom，目录号：8018）
玻璃纸（DINGGUO CHANGSHENG，目录号：XH444-1）
圆形（90mm直径）培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：101VIRR）}
灭菌纱布（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：22-415-469）
棉花种植罐（汕头兴乐园，尺寸：300 x 200 x 100）
灭菌移液器吸头（Corning，Axygen ^{®，目录号：TF-1005-WB-L-R-S）}
50ml锥形管（Corning，目录号：430828）
棉花种子（农业农业研究所，新路寨NO.16）
土豆块茎
甘油
蒸馏水（Milli-Q）（EMD Millipore，目录号：QTUM00ICP）
70％（v/v）乙醇（ddH 2 O中的EtOH）
30％H 2 O 2（ALADDIN，目录号：H112519）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：V900392）
琼脂（BD，Bacto ^TM，目录号：214010）
硝酸钠，NaNO 3（EMD Millipore，目录号：106537）
磷酸二氢钾，KH 2 PO 4（EMD Millipore，目录号：104873）
磷酸氢二钾，K 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：V900050）
硫酸镁七水合物，MgSO 4·7H 2 O（EMD Millipore，目录号：105886）
氯化钾，KCl（EMD Millipore，目录号：104933）
柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：V900095）
硫酸锌七水合物，ZnSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：Z4750）
硫酸铁（II）七水合物，FeSO 4·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：V900038）
硫酸铁铵（III）十二水合物，NH 4 Fe（SO 4 H 2）2·12H 2 O（Sigma -Aldrich，目录号：V900032）
硫酸铜（II）五水合物，CuSO 4·5H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C7631）
硫酸锰（II）一水合物，MnSO 4 H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：V900271）
硼酸，H 3 BO 3（Sigma-Aldrich，目录号：V900267）
钼酸钠脱水，Na 2 MoO 4·2H 2 O（EMD Millipore，目录号：106521）
蔗糖（Merck Millipore，目录号：107687）
Murashige和Skoog（MS）培养基，包括维生素（Duchefa Biochemie，目录号：M0222）
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（见食谱）
TES（见食谱）
最小介质（MM）（见配方）
MS液体介质（见配方）
Czapek-Dox培养基（参见食谱）

设备

加热板和煮锅煮土豆（苏泊尔，目录号：SDHC8E15）
用于制备溶液的烧瓶和磁力搅拌器（Thermo Fisher Scientific，Fisher Scientific，目录号：S88850206）
真菌生长培养箱（SAIFU，目录号：MJX-450S）
26℃孵化器（志诚，目录号：ZHWY-2102C）
高压釜（平山市，目录号：HVE-50）
洁台（智城，目录号：ZHJH-C1209B）
血细胞计数器用于分生孢子计数（邱静，目录号：QJ1102）
旋转器（Qilinbeier，目录号：QB-208）

程序

穿透试验
1. 移取V型20μl分生孢子悬浮液（3×10 7 /分钟/ml）。大丽花储存在-80℃的20％甘油中，并将悬浮培养物平板化到PDA板上，并在26℃下在黑暗中孵育5天。
2. 制备最小培养基（MM培养基），并在113℃下高压灭菌20分钟。将介质冷却至50-60°C后倒入板中，并在干净的工作台上干燥板。
3. 将玻璃纸的平片膜切成90mm直径的圆圈，并在113℃下高压灭菌20分钟。在步骤A2中制备的每个MM板上放一圈。
4. 使用灭菌的移液管接头将来自步骤A1的真菌接种到覆盖在MM培养基上的玻璃纸上。在黑暗中在26°C培养3天。然后去除膜并孵育培养基7天，以在底层培养基中观察菌丝以测定玻璃纸的破裂（图1）。
  
  图1.在玻璃纸膜上的渗透测定。 A.用具有V氏菌落的MM板展开膜。 dahliae 在接种后3天（dpi）。 B.殖民地。大丽花在底层介质上，表示玻璃纸的渗透
致病性分析
敏感高地棉（cv。新鲁仓第16号）和菌株V V592。大丽花在我们的实验室中用于致病性测定。
1. 灭菌棉籽15分钟，用蒸馏水冲洗3次。在室温下将种子浸泡过夜。在充满湿土的盆中发芽种子，用塑料圆顶覆盖一周，种植幼苗直到两个子叶完全展开。
2. 在每个盆中用MS液体培养基移植12个幼苗，并在接种V592之前用26小时光（8,000lux）/8小时黑暗循环生长大约2周。
3. 将条纹V592连接到新鲜的PDA板上（来自较旧的PDA板或甘油储备），并孵育1周。通过灭菌的叶片将一个板（90mm）的菌丝体转移到200ml Czapek-Dox培养基中，在26℃下在黑暗中以200rpm摇动3-4天以获得分生孢子。
4. 通过用4层灭菌纱布过滤真菌培养物来准备分生孢子悬浮液以去除菌丝体。使用血细胞计数器测量悬浮液中的分生孢子的浓度，并用Czapek-Dox培养基调节至约1×10 7 /分钟/ml的分生孢子。
5. 将具有两个真叶的幼苗的根部浸入步骤B4的分生孢子悬浮液中1小时（图2A）。将接种的幼苗放回MS液体培养基，每周供水一次
6. 以30dpi显示萎缩症状的棉花百分比计算疾病发病率（图2B）。每次试验，用3盆棉花重复感染测定至少三次。
  
  图2. V的致病性测定。大丽花。 A.用分生孢子悬浮液对棉苗进行根浸接种。 B.在30dpi的V代表棉花中的代表性疾病症状。大丽花。
真菌恢复
识别V的殖民化。大丽花在血管组织中，我们分离接种的棉花茎以回收真菌。
1. 在接种后30天切割棉花子叶上方的茎（图3）
2. 在50ml锥形管中，在70％乙醇中将茎切片灭菌1分钟，然后在40ml 10％（v/v）H 2 O 2 O 2/（用蒸馏水稀释30％[v/v] H 2 O 2 O 2）。在这个过程中，旋转器上的旋转器以20 rpm的速度旋转
3. 用无菌水冲洗茎三次，每次3分钟，并在26摄氏度的PDA培养基上在黑暗中培养。殖民地。大丽花可以在1周内在茎上生长（图3）
  
  图3.恢复V。来自受感染的棉花茎的大丽花

数据分析

获得至少三个生物重复数据，并使用单因素方差分析法用Microsoft Excel分析疾病发生率（表1）。

表1.疾病发病率分析疾病发病率以3盆感染棉花（3×12，共36只棉花）中的病棉百分比计算。测定重复3次

笔记

每个玻璃纸应通过滤纸分离，以防止在高压灭菌过程中粘附
为了防止玻璃纸膜的收缩，首先将其浸入灭菌水中，然后再放入MM板上。

食谱

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）
将200克去皮土豆在1升蒸馏水中煮沸20分钟
通过4层纱布渗透
加入20 g葡萄糖和20 g琼脂蒸馏水至1升
用113℃高压灭菌20分钟灭菌
TES
50克/升柠檬酸盐
50g/L ZnSO 4·7H 2 O
50g/L FeSO 4·7H 2 O
13g/L NH4Fe（SO4）2·12H2 O
2.5g/L CuSO 4·5H 2 O
0.5g/L MnSO 4·H 2 O
0.5g/L H 3/3> 3
0.5g/L Na 2 MoO 4·2H 2 O
储存于4°C
最小媒体
2 g/L葡萄糖
2g/L NaNO 3
1g/L KH 2 PO 4
0.5g/L MgSO 4·7H 2 O
0.5克/升KCl
0.02％（v/v）TES
20 g/L琼脂
用113℃高压灭菌20分钟灭菌
MS液体介质
0.1％（w/v）MS
Czapek-Dox媒体
30克/升蔗糖
3g/L NaNO 3
1 g/L K 2 HPO 4
0.5g/L MgSO 4·7H 2 O
0.5克/升KCl
100mg/L FeSO 4·7H 2 O
用113℃高压灭菌20分钟灭菌

致谢

该协议是从以下发表的论文：Bourett和Howard，1990年开发的。这项工作得到了中国科学院战略重点研究计划（XDB11040500）和中国转基因研究与商业化重点专项项目（2014ZX0800908B）的资助，。

参考文献

Bourett，TM和Howard，RJ（1990）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b90-044#.WH3qwPl95dg"target = "_blank"> 体外在稻瘟病菌稻瘟病菌中的渗透结构的开发 Can J Bot 68（2）：329-342。
高，F.，周，BJ，李，GY，Jia，PS，Li，H.，Zhao，YL，Zhao，P.，Xia，GX和Guo，HS（2010）。< a class = -insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21151869"target ="_ blank">在大肠杆菌中鉴定的富含谷氨酸的蛋白质诱变影响微管形成和致病性。 5（12）：e15319。
顾，SQ，Li，P.，Wu，M.，Hao，ZM，Gong，XD，Zhang，XY，Tian，L.，Zhang，P.，Wang，Y.，Cao，ZY，Fan，YS，Han ，JM and Dong，JG（2014）。 StSTE12 是通过调节附着物的发育和穿透而对于Setosphaeria turcica的致病性所必需的。 Microbiol Res 169（11）：817-823。
Kleemann，J.，Rincon-Rivera，LJ，Takahara，H.，Neumann，U.，Ver Loren van Themaat，E.，van der Does，HC，Hacquard，S.，Stuber，K.，Will， Schmalenbach，W.，Schmelzer，E.和O'Connell，RJ（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22496661 "target ="_ blank">通过植物病原体菌株的菌落和细胞内菌丝顺序递送宿主诱导的毒力效应物。 8（4）PLoS Pathog ：e1002643。
Klosterman，SJ，Subbarao，KV，Kang，S.，Veronese，P.，Gold，SE，Thomma，BP，Chen，Z.，Henrissat，B.，Lee，YH，Park，J.，Garcia-Pedrajas，MD ，Barbara，DJ，Anchieta，A.，de Jonge，R.，Santhanam，P.，Maruthachalam，K.，Atallah，Z.，Amyotte，SG，Paz，Z.，Inderbitzin，P.，Hayes，RJ，Heiman ，DI，Young，S.，Zeng，Q.，Engels，R.，Galagan，J.，Cuomo，CA，Dobinson，KF和Ma，LJ（2011）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21829347"target ="_ blank">比较基因组学得出植物血管枯萎病原体的利基适应性的见解 PLoS Pathog 7（7）：e1002137。
Yadeta，KA和Thomma，BP（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%282410fef0081c38b2544b2292d6afef16%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl = http％3A％2F％2Feuropepmc.org％2Farticles％2FPMC3632776％2F&ie = utf-8&sc_us = 7595819141780557962"target ="_ blank">木质部作为植物宿主和血管枯萎病原体的战场。 Sci 4（97）：1-12。
Zhang，T.，Jin，Y.，Zhao，JH，Gao，F.，Zhou，BJ，Fang，YY and Guo，HS（2016a）。真菌细胞中靶基因的宿主诱导的基因沉默赋予对棉花枯萎病病原体有效的抗性大丽轮枝菌大黄素< >> 9（6）：939-942。
Zhang，T.，Zhao，YL，Zhao，JH，Wang，S.，Jin，Y.，Chen，ZQ，Fang，YY，Hua，CL，Ding，SW and Guo，HS（2016b）。 class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27668926"target ="_ blank">棉花植物出口微RNA以抑制真菌病原体中的毒力基因表达。 a> Nat Plants 2（10）：16153.
Zhao，YL，Zhou，TT和Guo，HS（2016）。