材料和试剂

1.5 ml微量离心管
15ml管（Corning，Axygen ，目录号：SCT-15mL-25-S）
50ml离心管（Corning，Axygen ^{，目录号：SCT-50mL-25-S）}
培养皿（康宁，目录号：70165-60）
Hitrap FF Q柱：5 ml（GE Healthcare，目录号：17-5156-01）
NAP-5/25缓冲液交换柱（GE Healthcare，目录号：17-0853-02）
离心过滤器：10kDa，Amicon Ultra（EMD Millipore，目录号：PR02967）
0.22μm过滤器（Pall，目录号：PN 4612）
PCR管（Bio-Sharp，目录号：BS-02-P）
0.45μm过滤器
E。大肠杆菌菌株BL21（DE3）（New England Biolabs，目录号：C2527）
pGEX-6P-1-KaiC：由Carl Johnson教授（美国范德比尔特大学）提供。 KaiC编码序列来自细胞聚球蓝细菌PCC 7942
Bacto-tryptone（Oxoid，目录号：LP0042）
细菌酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
琼脂A（北京定格长盛生物科技，目录号：DH010）
氯化钙（CaCl 2）（1M; Sigma-Aldrich，目录号：V900266）
氨苄青霉素（1mg/ml;华北制药集团公司，目录号：A102048-25g）
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：16758）
谷胱甘肽S-转移酶（GST）树脂（EMD Millipore，目录号：70541）
PreScission蛋白酶（PSP）（GE Healthcare，目录号：27-0843-01）
卡那霉素（1mg/ml; GENVIEW，目录号：AK177-10G）
3x加载染料
三碱基（AMRESCO，目录号：0497）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：7647-14-5）
二硫苏糖醇（DTT）（生命科学产品与服务，目录号：DB0058-25g）
Tween-20（Enox，目录号：557）
ATP（Life Science Products& Services，catalog number：AB0020-25g）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
EDTA（Bio Basic，目录号：EB0185）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
SDS（生命科学产品与服务，目录号：SB0485）
双丙烯酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：146072）
过硫酸铵（APS）（西龙科学，目录号：51504）
TEMED（CUSABIO，目录号：V900853）
Pierce考马斯（Bradford）蛋白测定试剂盒（Sangon Biotech，目录号：C503031）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：115-39-9）
甲醇（天津凯美尔化学试剂，目录号：32058）
乙酸（恒兴，目录号：81601）
丙烯酰胺（AMRESCO，目录号：0341）
蛋白质标记（SM0431，Fermantas）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：26610）}
GSH（谷胱甘肽还原）（Sangon Biotech，目录号：A100399）
乙醇（恒兴，目录号：32061）
PSP缓冲（见配方）
缓冲液A（参见食谱）
缓冲液B（参见食谱）
反应缓冲液（见配方）
1 M IPTG（见配方）
10x运行缓冲区（请参阅配方）
8％分离凝胶（参见食谱）
5％堆积凝胶（见配方）
考马斯蓝染色溶液（参见食谱）
去污缓冲液（见配方）

设备

高压灭菌器（上海华西医疗器械，型号：HVA-85）
层流罩（SU周安泰，型号：SW-CJ-2F）
电热恒温箱（上海跃进医疗器械厂，型号：SHP-250）
移液器（Gilson，目录号：711111170000和711111050000）
轨道摇床（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：SHKE4000-1CE）}
高速冷冻离心机（日立，型号：CR21G）
冷冻离心机（Sigma Laborzentrifugen，型号：5811XQ 14241g）
台式离心机（Eppendorf，型号：1024和5424）
超低温冷冻机（海尔，型号：906）
微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：1500）
分析天平（Sartorius，型号：CP225D）
超纯水系统（Pall，型号：CascadA ZX）
膜过滤系统（EMD Millipore，USA）
超声波细胞处理器（Scientz Biotechnology，型号：SCIENTZ-IID）
FPLC系统（GE Healthcare，型号：AKTA净化器100）
精密pH计（Mettler Toledo，型号：EL-20）
电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-Protean Tetra）
脱色摇床（海门麒麟贝尔实验室仪器，型号：TS-8）
凝胶成像系统（柯达，型号：Gel Logic 200）
PCR系统（Biometra，型号：T-Gradient Thermoblock）

软件

ImageJ（版本1.8.0_77，NIH，USA）
Excel（2012版，微软，美国）

程序

E的转型质粒pGEX-6P-1-KaiC的大肠杆菌细胞
1. 将钙合成的BL21（DE3）细胞和pGEX-6P-1-KaiC质粒置于冰水中。
2. 通过分光光度法测定质粒浓度，并加入0.1μgpGEX-6P-1-KaiC到1.5ml管中的100μlBL21（DE3）细胞中。
3. 轻轻混合质粒和细胞，放入冰水中30分钟。
4. 将管置于42°C水浴中90秒，然后放入冰水中60秒。
5. 向管中加入400μlLB（Luria-Bertani）培养基（无抗生素），并使细胞在37℃，150rpm振荡器中回收45分钟。
6. 以6,000 x g（30秒）旋转细胞。
7. 弃上清，并将细胞重新悬浮于100μl新鲜LB培养基（无抗生素）中。
8. 将细胞均匀分散在补充有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基上
9. 将板在37℃孵育过夜直到菌落形成。
开凯的表达
1. 挑取含有pGEX-6P-1-KaiC的转化的BL21（DE3）细胞的单个菌落，并将其接种到灭菌的15ml管中的补充有100μg/ml氨苄青霉素的3ml液体LB培养基中。
2. 在37℃，220rpm下将细胞生长过夜。
3. 将1ml过夜培养物转移到3L烧瓶中的1L含有100μg/ml氨苄青霉素的无菌液体LB培养基中。
4. 生长培养直到OD 600在37℃，220rpm下达到〜0.6，将温度降低至28℃，并通过加入200μl1M IPTG诱导kaiC的表达。
5. 诱导16小时后，以7,000 x g，4℃离心5分钟收集细胞。
6. 将沉淀的细胞保持在冰上即时加工或储存在-80°C。
GST亲和纯化
1. 用100ml的玻璃烧杯中的40ml的PSP缓冲液将细胞从1L细胞培养物中彻底悬浮。
2. 将烧杯放入冰水中，以35％的输出功率通过超声处理45分钟破坏细胞（每超声处理1秒后等待2秒钟）。
3. 将溶液转移到新鲜的50ml管中，并在4℃，16,000×g离心40分钟。
4. 在离心过程中，取1ml GST树脂，并用5ml无菌ddH 2 O和3ml PSP缓冲液洗涤。
5. 将轨道摇床上的GST树脂与离心管的上清液（步骤C3）在4℃下混合2小时。
6. 用5ml的PSP缓冲液（4℃）重新悬浮树脂，并洗脱缓冲液以除去未结合的蛋白质。
7. 将PreScission蛋白酶添加到树脂中，并将溶液保持在4℃16小时，以允许酶消化GST标记的KaiC。
8. 将含有KaiC的上清液（或洗脱液）保持在4℃，进一步纯化步骤。
注意：
1. 在4℃下孵育树脂混合物时，使用轨道摇床（40rpm）。
2. 在每个步骤（包括以下阴离子交换纯化中的步骤）中储存10μl样品，首次在-20°C进行评估。
阴离子交换净化
1. 设置FPLC机器，打开280nm紫外线灯进行检测。
2. 在FPLC机上安装5ml的Hitrap FF Q柱，并用25ml的ddH 2 O和然后以4.0ml/min的速度洗涤25ml缓冲液A.
3. 使用NAP-25缓冲液交换柱从最后一步与缓冲液A的KaiC蛋白质的交换缓冲液，并将样品以2.0ml/min加载到柱上。
4. 用缓冲液A洗涤柱直到280nm处的吸光度达到基线。
5. 用10％缓冲液B（90％缓冲液A）洗涤柱以除去非特异性结合的蛋白质。
6. 设置10-50％缓冲液B线性梯度洗脱程序70分钟，收集含有KaiC的蛋白质峰（〜40分钟）。
7. 将KaiC样品保持在4°C。
注意：
1. 用于FPLC纯化的所有缓冲液和样品必须通过0.22μm过滤器进行过滤。
2. 对于第一次纯化试验，强烈推荐使用线性梯度洗脱步骤
储存开凯
1. 为了储存纯化的KaiC蛋白质，使用10kDa离心过滤器，在4℃，3,000rpm下将KaiC样品从最后步骤（步骤D7）浓缩至1-5mg/ml。
2. 使用NAP-5缓冲液交换柱的反应缓冲液的交换缓冲液。将KaiC样品浓缩至1-5 mg/ml，并将蛋白质储存在-80°C。
注意：
1. 用Bradford测定法确定样品的浓度。
2. 我们建议立即使用蛋白质进行以下程序。为了储存，加入20％甘油，在液氮中冷冻并保持在-80℃。请注意，长期存储（2-3个月）可能会导致KaiC的活动损失。
KaiC样品的制备用于SDS-PAGE分析
1. 取出储存在-80°C的KaiC蛋白质并在冰上解冻。
2. 用补充有80μg/ml卡那霉素的反应缓冲液将KaiC稀释至0.5mg/ml，终体积为30μl。
3. 将4μl稀释的KaiC样品转移到标记为管1至5的清洁和灭菌的PCR管中
4. 向样品管1中加入2μl3x负载染料，并在100℃孵育5分钟。
5. 将样品1储存在-20°C，并将样品2-5 - 4°C转移。
6. 24小时后取出样品2，如上所述进行准备。
7. 将样品管3-5置于PCR机中，并将样品温度设定为30℃。
8. 每4小时取一管，如前所述进行准备。
KaiC自动磷酸酶活性的SDS-PAGE分析
1. 取出储存在-80°C的KaiC蛋白质并在冰上解冻。
2. 用补充有80μg/ml卡那霉素的反应缓冲液将KaiC稀释至0.5mg/ml，终体积为30μl。
3. 将4μl稀释的KaiC样品转移到标记为管1至5的清洁和灭菌的PCR管中
4. 向样品管1中加入2μl3x负载染料，并在100℃孵育5分钟。
5. 将样品1储存在-20°C，并将样品2-5 - 4°C转移。
6. 24小时后取出样品2，如上所述进行准备。
7. 将样品管3-5置于PCR机中，并将样品温度设定为30℃。
8. 每4小时取一管，如前所述进行准备。
注意：
1. 在这个方案中，每个孔中最好的开CaC量是2-3μg。
2. 在样品旁边的孔中加入10μl加载染料，以减少"微笑效应"

数据分析

KaiC纯度评估
由于蛋白纯度对于蛋白质的活性和稳定性很重要，因此通过SDS-PAGE检查纯化的KaiC蛋白的纯度。如图1所示，用该方案制备的KaiC是高纯度的，分子量对应于58kDa的预测值。

图1.纯化KaiC
的SDS-PAGE分析
开凯自动磷酸酶活性分析
为了确定纯化的KaiC的自磷酸酶活性，通过SDS-PAGE分析在不同时间点（1-5）制备的样品。图2清楚地显示了在30℃下在反应缓冲液中单独孵育时KaiC的去磷酸化。下段是去磷酸化的KaiC，上限是磷酸化的KaiC

图2.KaiC的自动磷酸酶活性的SDS-PAGE分析。在30℃孵育前，将KaiC在4℃下孵育24小时（-24小时）。每4小时取样一次。
定量KaiC自动磷酸酶活性
为了定量分析KaiC的去磷酸化，使用ImageJ（Schneider等人，2012）分析SDS-PAGE凝胶。在ImageJ中打开SDS-PAGE凝胶的高质量图像。在第一个通道中打开KaiC乐队，并选择"Analyze-Gels-Select First Lane"。将框架移动到下一个通道，同时保持其大小不变以覆盖开启频段，然后使用"Analyze-Gels-Select Next Lane"功能。对所有车道重复此过程。使用"Analyze-Gels-Plot Lanes"功能绘制KaiC波段的峰面积。然后用线工具绘制基线，以关闭对应于凝胶中KaiC带的独立峰面积。使用"魔杖工具"逐个选择封闭的峰值区域。一个新窗口将显示计算出的峰面积。最后，计算每个泳道中磷酸化KaiC带的百分比，并分析Excel或其他类似软件中的数据（图3）。

图3.KaiC的自动磷酸酶活性的定量分析。通过ImageJ分析每个泳道中磷酸化KaiC（P-KaiC）的百分比。
注意：ImageJ中的基线校正以某种方式是任意的，但对于所有峰值应保持不变。

食谱

PSP缓冲区
50mM Tris-HCl（pH8.0）
150 mM NaCl
1 mM DTT
0.01％Tween-20
1 mM ATP
5mM MgCl 2
缓冲区A
50mM Tris-HCl（pH8.0）
1 mM DTT
0.01％Tween-20
1 mM ATP
5mM MgCl 2
缓冲区B
50mM Tris-HCl（pH8.0）
1 M NaCl
1 mM DTT
0.01％Tween-20
1 mM ATP
5mM MgCl 2
反应缓冲液
50mM Tris-HCl（pH8.0）
150 mM NaCl
5 mM ATP
5mM MgCl 2
0.01％Tween-20
0.5 mM EDTA
1 M IPTG
将1 g IPTG溶解在4,196μl去离子水中，制成1M溶液用注射器和0.22μm过滤器过滤灭菌
10x运行缓冲区
144克甘氨酸
30.3克Tris
10g SDS
将ddH ₂ O添加到1 L
8％分离凝胶（表1）

表1：8％分离凝胶的制备
5％堆积凝胶（表2）

表2. 5％堆积凝胶的制备
考马斯蓝染色液（1升）
1克考马斯蓝G250
650ml ddH 2 O
250毫升甲醇
100 ml乙酸
脱色缓冲液（1L）
600毫升ddH 2 O
100ml乙酸

注意：

所有缓冲液均应用0.45μm过滤器灭菌。
将缓冲液存放在4°C不到一周的时间

致谢

这项工作是由向S.L.来自中国湖北省国家自然科学基金（91330113，31670768），中国湖北省（D20161204）和中国三峡大学。参考文献发表在Sci Rep 6：25129中。

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