材料和试剂

手套
1.5 ml无菌微量离心管
10,100,1000个微量吸头尖端
无菌工艺纸
Ziploc袋（乙醇漂洗）
无菌拭子（最好是海绵顶）
植物叶（ Espeletia sp。）〜10 g（可能更多取决于下游应用）。在加工前1-2天收集叶子，在干冰上运输，并在4℃下储存在无菌塑料袋中
无菌dH 2 O
100％乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
5.25％次氯酸钠（Quidiscol Ltda，波哥大，哥伦比亚）
功率土壤DNA分离试剂盒（MO BIO Laboratories，目录号：12888-50）
磷酸氢二钠，Na 2 HPO 4（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
麦芽提取物固体培养基（OXOID，目录号：CM0059）
Tris碱（Promega，目录号：H5133）
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
HCl（Mol Labs，目录号：V4653）
0.5 M NaH 2 PO 4（参见食谱）
NAP缓冲区（见配方）
麦芽提取物固体培养基（参见食谱）
TE缓冲（见配方）

注意：所有使用的试剂都有特定的制造商和目录号。尽管如此，用户可以使用任何分子级试剂进行协议

设备

无菌500-1,000毫升烧杯，高压灭菌
1-25微升微量移液管
10-100微升微量移液管
100-1,000微升微量移液管
无菌剃须刀
涡流
无菌镊子
25℃孵化器
无菌玻璃珠，高压灭菌
层流罩，优选为II类BSC以避免污染
迷你珠打击机96（BioSpec产品）
Qubit ^® 2.0荧光计（Thermo Fisher Scientific，USA）
高压灭菌器

程序

从 Espeletia sp。植物（50至100克）在无菌工艺纸和干冰上的Ziploc袋中运送到实验室。然后将来自每株植物的一组叶子用于内生真菌DNA提取。
首先用无菌dH 2 O O清洗整个完整的叶子以除去污垢;该洗涤是通过首先将叶子浸没在无菌dH 2 O 2中，足以覆盖整个叶子（在1L烧杯中约500ml），然后用清洁的dH 2 < / sub> O使用100-1,000微升微量移液管。
将完整的叶子放置在1L无菌烧杯中的NAP缓冲液（500ml）中，并振荡1分钟以去除驻留在植物表面上的附生微生物。通过使用无菌剃刀剃须来除去存在于埃斯佩雷西亚植物叶子上的细短毛或表面柔毛，因为这有助于随后的灭菌过程。
剃须后，通过用无菌H 2 O 2（对于大叶子约为100ml）移液三次冲洗叶子，然后浸没在：

500毫升90％乙醇，在1000毫升烧杯中放置60秒注意：这取决于叶子的大小;烧杯和乙醇的体积可以更小。
5.25％次氯酸钠溶液在类似的烧杯中6分钟
70％乙醇30秒。
在这种灭菌过程中，重要的是要完全浸没在每个溶液中的叶片样品，溶液应该是无菌的，并且所有的物质都应优选在罩中进行，以避免可能的空气污染。叶片样品使用无菌镊子从一种溶液转移到另一种溶液。

使用1,000μl微量移液管，用无菌蒸馏的H 2 O 2终止完整的叶子样品。
通过使用无菌镊子在固体麦芽提取物培养基板上印刷每片叶片来检查灭菌。
将板在25℃下孵育长达三周，并每天检查生长。孵育在25°C进行，因为环境分离物往往倾向于低于37°C的温度。灭菌过程也可以用液体介质进行。
使用无菌剃刀将叶切成小块，称出一克。使用无菌剃刀将这些1g片段进一步切成0.1至0.5mm切片，并置于含有1g无菌0.1mm直径的玻璃珠和1ml TE缓冲液的1.5ml Eppendorf管中。或者，也可以将叶片首先切成0.1至0.5mm切片，混合，然后称重，得到1克样品。立即处理植物材料用于提取DNA，但只有在固体或液体培养基中长时间孵育后证明无菌的样品（步骤7）才用于微生物群落的分析。
然后将植物材料在室温（20-25℃）下在微型珠打浆机中以36次振荡/秒均化5分钟。
根据制造商的说明书，使用Power Soil DNA Isolation Kit提取DNA，为单次提取添加推荐的溶液体积。
注意：在某些情况下，单个样本可以执行多次单独的提取。
按照制造商的说明书，使用Qubit 2.0荧光计量化提取的DNA。也可以通过凝胶电泳显示DNA的质量，但这取决于所获得的DNA的量，通常较低。

笔记

在灭菌期间，叶子被完整地处理，叶片材料和水或NAP缓冲液的量取决于叶子的大小。
使用固体培养基检查离开样品的灭菌，但也可以使用液体培养基。在这种情况下，灭菌的叶片可以短暂地浸没在液体培养基（1-2分钟）内，漂洗，然后将培养基孵育数天或数周，每天检查生长。任何一种培养基中的生长表明不完全消毒，因此各样品必须丢弃或重新消毒
根据下游应用所需的DNA量，可以使用更多的植物材料。如果您可以使用可以容纳更大体积的珠子搅拌器，您可以添加更多的叶子组织，并可能在最后增加DNA产量。

食谱

0.5M NaH 2 PO 4（500ml）
34.50g NaH 2 PO 4（F.W.137.99）
〜450ml dH 2 O O 溶解，然后与dH ₂ O
卷起通过121℃高压灭菌15分钟来消毒
注意：制备更浓缩的溶液（0.5M），因此更容易稀释至所需浓度（124mM）。
NAP缓冲区
124mM Na 2 HPO 4
麦芽提取物固体培养基
50克MEA粉末
1L的dH 2 O
通过在115℃下高压灭菌10分钟来消毒
TE缓冲区
10 mM Tris
10 mM EDTA
将pH调节至8.0

致谢

这项工作由Colciencias（合同号573-2012和649-2013）提供资金，并根据MADS第76-2013号合同获取遗传资源和UAESPNN研究许可证编号PIDB DTAO 021-10。该协议改编自以前发表的作品（Miles等人，2012; Araujo等人，2002）。作者宣称他们没有利益冲突可能影响本协议实施的设计。

参考文献

Araujo，WL，Marcon，J.，Maccheroni，W.，Jr.，Van Elsas，JD，Van Vuurde，JW and Azevedo，JL（2002）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12324338"target ="_ blank">内生细菌群体的多样性及其与柑橘类植物中的Xylella fastidiosa的相互作用。 Appl Environ Microbiol 68（10）：4906-4914。
Miles，LA，Lopera，CA，González，S.，deGarcía，MC，Franco，AE和Restrepo，S。（2012）。＆nbsp; 探索安哥拉哥伦比亚Paramo生态系统的真菌内生真菌的生物防治潜力。 BioControl 57（ 5）：697-710。
Yan，Q.，Bi，Y.，Deng，Y.，He，Z.，Wu，L.，Van Nostrand，JD，Shi，Z.，Li，J.，Wang，X.，Hu，Z.， Yu，Y. and Zhou，J.（2015）。＆nbsp; 三峡大坝对微生物结构和潜在功能的影响。 5：8605。