材料和试剂

35 mm培养皿（Corning，Falcon ^®，目录号：351008）
盖玻璃（Ted Pella，目录号：260364）
玻璃幻灯片
硅晶片（4"测试级）（大学晶圆，目录号：452）
丙烯酸（PMMA，2mm厚）（Sigma-Aldrich，目录号：GF10188996）
35mm细胞培养皿（Sigma-Aldrich，目录号：D7804）
石蜡膜（Sigma-Aldrich，目录号：P7793）
铝箔
0.22μm过滤器
细胞
注意：我们的协议可用于贴壁和非贴壁细胞。例如，MCF7，MB-MDA-231，MCF10A，神经球等。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Dow Corning，目录号：SYLGARD 184硅氧烷弹性体试剂盒）
纯乙醇（Decon Labs，目录号：V1001）
（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPS）（Gelest，目录号：4420-74-0）
Sulfo-GMBS，N- [γ-马来酰亚胺丁酰氧基]磺基琥珀酰亚胺酯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：22324）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
单克隆抗人CD63抗体（Ancell，目录号：215-820）
牛血清白蛋白（BSA功率）（Sigma-Aldrich，目录号：A8531）
多聚甲醛溶液（PBS中4％）（Affymetrix，目录号：19943 1 LT）
生物素化抗CD63（Ancell，目录号：215-030）
Qdot ^®孵育缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：Q20001MP）}
（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{，目录号：Q10091MP）的量子点（Qdot）} 545 ITK ^TM
具有Tween 20（TBST-10x）（Cell Signaling Technology，目录号：9997）的Tris缓冲盐水
去水
阻塞缓冲区（见配方）
Qdot阻塞缓冲区（见配方）
1 TB TB（见配方）

设备

CNC（电脑数控）微型铣床（Minitech Machinery，型号：Mini/Mill/1）
迪斯科自动切割锯3220（Nano3，型号：3220）
等离子体蚀刻系统（用于清洁）（Plasma Etch，型号：PE-100）
苏打粉二氧化硅玻璃培养皿（康宁，目录号：70165-152）
标准生物安全柜
振动筛（VWR，型号：VWR Mini振动筛）
烤箱
1毫升移液器
显微镜（KEYENCE，型号：BZ-9000，类似于BZ-X700）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：CL2）
镊子
细胞计数器

设备1-3可以在核心设施中找到，如微/纳米晶圆厂。请参见UCSD的Nano3设施。设备1也可以在大多数机器商店中找到。
选择离心机适合35毫米的菜肴。如果您有一个适合6孔板的离心机，则可以用6孔板代替35毫米的料理。

程序

用于分析外来体分泌的单细胞测定的总体程序如图1所示。准备每种材料的详细信息将在步骤2中进行描述。

图1.用于分析外来体分泌的单细胞测定的工作流程.A和B.将单细胞加载到含有通孔阵列的细胞加载芯片的培养皿中。细胞装载芯片可以在细胞附着后去除。 D.将表面官能化的玻璃载玻片放置在细胞上方100微米的CNC加工框架中。 E.由相应细胞分泌的收集的外来体的玻片。捕获的外来体用另一种生物素化抗体和链霉抗生物素蛋白结合的量子点标记，在荧光显微镜下变得可见。
准备一个可装入35毫米盘的电池加载芯片。推荐在5 x 5 mm 2和12 x 12 mm 2之间的芯片尺寸。还建议由PDMS制成的电池加载芯片（Chiu等人，2016）。
数控加工夹具

设计一个外径为35毫米盘的夹具。夹具的内部平方度比用于外来物质收集的覆盖玻璃（图2）更大（每边）为50μm（图2）。

图2.适合35毫米盘和外来物收集盖玻璃的加工PMMA

使用数控系统加工PMMA

对于直接装载到盘上的贴壁细胞或细胞，连接四个切片硅片（100μm×3mm）（注意：我们使用PDMS附着）作为细胞与收集玻璃之间的间隔物（图3）。

对于非贴壁电池，加工后的PMMA可以在洗涤后使用。

使用75％乙醇和UV清洁机加工的PMMA 15分钟。
注意：我们使用标准的生物安全柜UV灯。

图3.带有4 100μm间隔物的夹具，以保持盖玻璃和电池之间的距离
将抗体固定在盖玻片上（此步骤约需4-6小时）

骰子盖玻璃成7×7毫米尺寸。

使用切割机在盖玻璃一侧切割〜30微米深的基准。基准的设计如图4所示

图4.具有30μm深度基准的盖玻璃

使用O 2等离子体（等离子体蚀刻系统，PE100）在玻璃杯的每一侧用200W清洁玻璃盖1.5分钟。

硅烷化

准备一个无菌的35毫米玻璃皿注意：对于硅烷化，我们使用玻璃皿而不是塑料盘。

将3ml乙醇加入盘中

加入120μl（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPS）到培养皿中（得到4％v/v MPS）并充分混合。

在200rpm的摇动器下将玻璃盖在4％MPS溶液中浸泡30分钟。
注意：平面没有基准面朝上。

准备一个新的35毫升培养皿与3毫升乙醇

将玻璃片转入新碟中，以200rpm摇动5分钟。

再次重复步骤3d.v和3d.vi两次。

将玻璃片转移到新的玻璃皿中。

将玻璃载玻片放入100°C的烘箱中，将载玻片干燥30分钟（直到完全干燥）注意：新鲜使用。立即进入下一步。

Sulfo-GMBS涂层

称量0.764 mg Sulfo-GMBS。

将Sulfo-GMBS溶解在2ml PBS中，以在35mm玻璃皿中得到1mM sulfo-GMBS溶液。

将玻璃罩浸入溶液中。

将玻璃皿放在振荡器上，转速为200转/分，孵育10分钟，再摇动30分钟

用PBS（3ml）冲洗5分钟，摇动器以200rpm冲洗3次注意：在这里我们用塑料盘洗PBS。

抗CD63抗体固定

准备35毫米培养皿。

将2ml PBS加入盘中，轻轻摇匀，使整个表面湿润。

将5μg（5μl）抗CD63 Ab加入盘中（〜0.05μM）

使用1毫升移液器将溶液混合20次

将盖玻片浸入抗CD63 Ab溶液中。

在4℃下培养皿2小时。

用PBS（3毫升）冲洗培养皿5分钟3次，摇床上以200转/分。

阻断未反应的GMBS

将3ml 5％牛血清白蛋白（BSA）溶液吸入无菌的35mm培养皿中

在4℃下将玻璃浸入BSA溶液中30分钟。

存储

将处理后的玻璃杯浸入4℃的PBS中注意：
1）在BSA封锁后，无需用PBS清洗。
2）被处理的护罩玻璃可以储存至少2个月。（我们从未尝试过比这个持续时间更长的时间。）
单电池加载

在35毫米细胞培养皿的中心附着电极负载阵列（用于贴壁细胞的通孔PDMS或用于非贴壁细胞的PDMS孔）。图5是通孔PDMS粘附到35mm盘的示例。

图5.通孔PDMS粘附到35 mm盘
将CNC加工的夹具放在电池加载阵列的顶部。
注意：对于非贴壁细胞，放置固定装置后装入细胞;对于粘附细胞，在装载后放置固定装置并剥离PDMS网。

如果夹具设计成适合35毫米盘的内径，则可以将其直接放置在PDMS的顶部。
如果固定装置的设计不符合35 mm的内径，则需要使用一些未固化的PDMS将固定装置的侧面密封到电池装载阵列。使用前请确保PDMS完全固化。

使用O 2等离子体以200W处理整个盘（盖帽打开）30秒。这将使PDMS更亲水。
在紫外线（15 W）下灭菌整个餐具15分钟。
将2-3ml培养基分配到培养皿中并在37℃下保存过夜（至少4-6小时取决于孔的大小）。这一步将有助于清除PDMS井中捕获的小气泡，并在升温后确保没有气泡
在收集细胞之前，请在显微镜下检查，并确保PDMS孔中没有气泡
根据正常程序收获细胞。
用培养基稀释细胞以达到合适的密度。对于尺寸为40-50μm和250μm分离（中心到中心）的50×50荷载孔阵列，每毫升约50,000-100,000个细胞将产生良好数量的单细胞。
将稀释的细胞吸入培养皿中，并通过将稀释的细胞移液几次使细胞匀浆。
用Parafilm密封盘。
将盘放在离心机中，并使用盖子带固定盘子。每次两个菜肴都有助于平衡离心机（视频1）。

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视频1.通过离心机加载细胞

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在140 x x离心1分钟。
离心后，检查显微镜下的负载情况（物镜的2x或4x）。你会看到单/双胞细胞覆盖了75％以上的井。如果加载效率太低，可以重复步骤4i-4l。
清除不需要的单元格

对于贴壁细胞，让细胞沉淀6-8h，然后移除PDMS网。去除后，不需要的细胞将被剥离与PDMS网格。用介质洗涤整个板3次。
对于非贴壁细胞，离心后，将培养皿倾斜45-60度，并用移液管冲洗表面。用干净的介质重复此步骤2-3次。

外来物系集合
注意：步骤6,7和8将需要约10小时，包括3小时的外来体收集。我们建议在一天内完成6-8，不间断。

开始收集过程中，吸入培养皿中的培养基并用无外来物质的培养基或PBS冲洗。
将外来体免费培养基分配到盘中
仔细取出第3步处理的护目镜（视频2）。

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视频2.将经过处理的盖玻片放在加载阵列的单元格顶部

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翻盖盖玻璃。让平坦的表面没有基准面朝下。将玻璃滑块放入CNC加工的PMMA夹具（视频2）。
将细胞放回培养箱中，根据实验计划等待1-3小时。

图像样本和外来体固定

在外来体收集后，用显微镜拍摄整个菜肴图像。使用基准点找到焦平面。
准备一个装有2ml 4％多聚甲醛PBS的35 mm培养皿。
用镊子取出盖玻璃。
翻转盖玻片，让平面（无基准面）朝上，并将载玻片立即浸入多聚甲醛中室温30分钟。
注意：不要忘了翻盖玻璃。

标签Qdots

在外来体固定后，用1x PBS洗涤3次，每次在200rpm下5分钟。
封锁

将盖玻片浸入5％BSA，室温2小时
封闭后，用1x PBS洗涤3次，每次在200rpm下5分钟。

标记生物素化抗CD63 Ab或其他抗体

准备35毫米培养皿。
创建800μlPBS，200μl5％BSA和2.5μl生物素化抗CD63 Ab的溶液。
将玻璃罩浸入溶液中4小时。
用1x PBS洗涤3次，每次在200rpm下5分钟。

封锁

在Qdot孵育缓冲液中制备5％BSA
将5％BSA的Qdot孵育缓冲液分配到35 mm培养皿中。
注意：建议使用500μl7 x 7 mm-12 x 12 mm的幻灯片，以节省Qdot的费用。从碟子边添加封闭缓冲液，直到缓冲器覆盖玻璃。
将玻璃片在室温下浸入缓冲液中2小时。

质量标签

混合1 ml Qdots孵育缓冲液和10μlQdots，得到10 nM Qdot溶液
在室温下将盖玻片浸入溶液中1小时。用铝箔覆盖盘子。
注意：在此步骤之前无洗涤过程。

洗涤

预热1x TBST缓冲液和去离子水在50℃下30分钟，然后再进行Qdot标记
加入2 ml 50°C 1x TBST放入新菜中，并用1 TB TB溶液将盖玻片转移到盘中。
将盘放在振荡器上，以200rpm冲洗5分钟。
重复步骤7f.ii-7f.iii三次。
加入2ml 50°C去离子水（DI水）到另一个盘中，并将玻璃片转移到其中
将盘放在振荡器上，以200rpm冲洗5分钟。
重复步骤7f.v-7f.vi三次。

脱水

在每个清洁盘中分配2ml 30％乙醇，50％乙醇，75％乙醇，90％乙醇和2份100％乙醇。
注意：串联级分的乙醇溶液用无菌ddH 2 O制备。
将洗涤后的样品浸入30％乙醇中30秒，50％乙醇30秒，75％乙醇30秒，90％乙醇30秒，2次100％乙醇30秒。
将玻璃转移到干净的表面，让其风干。干燥时用铝箔盖住。

成像和计数

在外来体上注册基准相对于细胞阵列的位置收集的玻片。

打开在步骤6拍摄的包含基准，例如，交叉图案的图像。
使用4x显微镜物镜在电脑屏幕上显示图像。
用一块透明度盖住电脑屏幕（图6）

图6.带有标记的单元格位置（红点）和基准（交叉图案）的透明度
使用黑色标记来追踪透明度上基准点的边缘。
使用红色标记在透明度上绘制单元格位置。
一个透明度可以覆盖玻璃上的〜5 x 6 mm ²区域。如果单元阵列的大小大于4x目标的视野，则在另一个交叉基准位置使用另一个透明度。

将倒置显微镜放置在载玻片内，将外来体侧朝下（即，面向显微镜的物镜）朝下。我们使用双面胶带将玻璃盖的边缘粘贴在玻璃滑板上。
注意：双面胶带会产生很多荧光信号。请勿将胶带与样品区重叠。
注册外来体收集站点/细胞装载位点

在此步骤中，我们将把玻片上的外来体收集位点注册到视野的中心，最初使用2x/4x物镜，然后用100x物镜计算标记外来体的量子点。

在屏幕上粘贴标记的透明度（图7A）。

切换到2x/4x物镜或任何低倍率。

移动样品台，直到玻璃滑块上的基准与玻璃上绘制的基准线对齐（图7B）。

标记中心位置的透明度。这将成为100x目标下的中心区域。

选择一个单元格加载站点（Cell-1）。调整样品台以将选定的单元格加载位置移动到中心位置（标记为图7C中的中心）。将该位置的样品台的千分尺读数记录为位置-1。

图7.注册第一个单元格加载站点。 A.在标有透明度的计算机屏幕上查看玻片的图像。 B.移动玻璃滑块，将基准与透明胶片上的标记位置对齐。 C.将所选择的单元格加载位置（Cell-1）移动到透明度的中心位置，该中心位于100x目标的中心区域。

要注册其余的外来物种收集站点，只需计算所选择的位点离开第一个细胞的多少个斑点（红色圆圈）（Cell-1）。在2x/4x物镜下，根据透明度上的红色圆圈移动样品台的微米。这将使外来物种收集站点移动到图像中心（图8）。

通过重复步骤9c.vii注册所有外来物种收集站点。

图8.注册其余的单元格位置
成像

切换到100x物镜
应用实时雾度减少和随机噪声消除（如果适用）。这将有助于从长曝光时间产生的噪声信号中识别Qdot信号。图9A示出了雾度降低之后的图像的示例。
将曝光时间增加到1.5-2.5秒。使用长时间曝光时间更容易区分Qdots和随机噪声。虽然您可能在显示器上看到，Qdots总是比噪音更亮。
缓慢调整对焦以查看Qdot信号。
仔细优化焦点，以获得最高的Qdot图像对比度。
拍摄长时间曝光的图像，例如，建议使用2.5秒。

Qdots计数

黑平衡。选择一个区域并调整黑色天平，直到屏幕上显示调光器Qdots。图9显示黑平衡后的噪声降低示例。
注意：建议在调整黑平衡时将图像显示为原始尺寸。由于计算机屏幕的设置或功能，某些Qdots可能不可见。
使用细胞计数器来计数照明点。仔细设置阈值。
重复步骤8f.i和8f.ii计数所有图像。

图9. Qdots图像的示例。 A.雾度降低和随机噪声消除后的图像。红色矩形区域在非常长的曝光时间内显示背景噪音。黄色圆圈是具有不同强度的Q点的示例。黑色平衡后的图像。

数据分析

哪里，
R：单细胞外分泌细胞分泌率，
N：与细胞位置相对应的外来体收集载玻片区域中的Q点数，
N _n：噪声级别，
C：一个站点中的单元号，
T：外来体收集时间。
我们最初只拍摄了包含单个单元格的网站。如果在实验过程中细胞分裂，我们假设该位点中所有细胞的外来体分泌速度相同。

笔记

洗涤：我们每个洗涤步骤都使用干净的35毫米培养皿。
在步骤8c，可以根据研究的目的选择不同的抗体靶向外来体。这里我们使用抗CD63抗体作为例子。
在步骤8e成像，如果很难找到Qdots飞机，可以按照以下步骤：

在较低的放大倍数（2x或4x）下，将基准点移动到视图的中心。

切换到100倍放大倍数。基准仍应在视野内看到。如果没有，请调整样品台，直到基准图案在视野中显示。如图10所示，尝试专注于平面1。

继续降低镜头（，使镜头远离玻璃片），直到基准面的最低平面在图10中被标记为平面-2。现在可以确定显微镜是在玻片的顶表面和底表面之间成像z位置。

持续降低镜片，Qdots和Exosomes应处于图8所示的平面-3处。

图10.查找外来体的焦平面

食谱

阻塞缓冲区

将0.5g BSA溶解于25 ml PBS中
用0.22微米过滤器过滤溶液
将5％BSA缓冲液储存在4°C

阻止Qdot的缓冲区

将0.5 g BSA溶解于25 ml Qdot缓冲液中
用0.22微米过滤器过滤溶液
将5％BSA Qdot缓冲液储存在4°C

1x TBST
用DI水稀释10倍TBST

致谢

我们承认2016年6月12日（27），第3658-3666页的期刊出版物。本协议从本小文章的实验部分进行修改。作者承认圣地亚哥纳米技术基础设施（SDNI）的工作人员的技术支持，该基金会是国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的一部分。本出版物报道的研究得到了国家卫生研究院国家卫生研究所（NIGMS）的授权号R21GM107977和国家卫生研究院生物医学影像与生物工程国家研究所（NIBIB）的支持，获得了R43EB021129号。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。余浩华拥有可能受益于研究成果的公司Nanocellect，Inc.的股权。他是该公司的共同创始人，也是该公司科学顾问委员会的成员。

参考文献

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Théry，C.，Amigorena，S.，Raposo，G.和Clayton，A。（2006）。从细胞培养上清液和生物液体中分离和表征外来体。第3章：第3单元。