材料和试剂

棉绒（例如，Thomas Scientific，目录号：2904W25）
海砂（方英石，Brenntag Schweizerhall AG）（例如，格罗格化学公司，目录号：G890）
圆底试管，约100 x 16毫米（助手，目录号：42775045）
TLC板（在20×20cm铝上的TLC硅胶60°F 254°）（EMD Millipore，目录号：100390）
玻璃毛细管（MARCHEREY-NAGEL，目录号：814022）
2 ml 9 mm ScreVial，透明玻璃12 x 32 mm（Infochroma，目录号：G004-HP-H）
9毫米毫米无色无氟PTFE /硅胶/PTFE隔膜的螺帽（Infochroma，目录号：G004-HP-CB-FKSKFK10）
1.5ml Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030120086）
植物材料：Capparis蜕膜根瘤皮（巴基斯坦Sahiwal收集），巴基斯坦巴哈瓦尔布尔伊斯兰教大学Cholistan沙漠研究所M。Waris先生鉴定;
MeOH（甲醇，技术级，使用前蒸馏）（Thommen Furler，目录号：203-VL54TE）
SiO 2（Merck硅胶60 [40-63μm]）（EMD Millipore，目录号：109385）
氢氧化铵（NH 3，氨水溶液25％，puriss p.a.）（Honeywell，目录号：30501）
氯仿（CHCl 3，用EtOH稳定）（Scharlab，目录号：CL02181000）
二氯甲烷（CH 2/2 Cl 2），技术级，使用前蒸馏）（Thommen-Furler，目录号：739-VL54TE）
（Honeywell，目录号：32203）
的Diethylether（Et 2 O，puris p.a.，用BTH稳定，用NaOH蒸馏）注意：

纯乙醚对氧化敏感，长时间暴露于空气和光线时可形成爆炸性过氧化物。因此，通常用抗氧化剂丁基羟基甲苯（BHT）稳定，蒸馏除去。因此，蒸馏醚再次易于形成环氧化物，如果溶剂暴露于空气和光照几天，则需要在使用前对蒸馏醚进行过氧化物测试。
为了测试过氧化物，请使用：Quantofix ^®过氧化物试棒（Sigma-Aldrich，目录号：Z101680）。

甲胺溶液（MeNH 2 O，40wt。％）（Sigma-Aldrich，目录号：426466）
盐酸（HCl，37％）（用于分析，默克）（EMD Millipore，目录号：100317）
乙腈（MeCN，LC-MS Ultra CHROMASOLV ）（Honeywell，目录号：14261）
甲酸（HCO 2 H，99％，ULC/MS）（Biosolve，目录号：069141）
2-丙醇（LC-MS Ultra CHROMASOLV ^{®）（Honeywell，目录号：650447）}
氢氧化钠溶液（HPCE的NaOH，H 2 O的0.1N）（例如，MSP KOFEL，目录号：5062-8575）
H 2 PtCl 6
KI
Ce（SO 4）2
H 2 2< 4>< 4>
Schlittler试剂（参见食谱）
Ce（SO 4）2< 2>溶液（参见食谱）

设备

锋利的斧头（例如，，TRANSA，目录号：040929-001001）
包覆的发酵罐（50L，例如Braupartner，目录号：141-0）
过滤器滤布（75×75cm，例如，ErwinMüller，目录号：i10014278）
不锈钢刮刀（例如，Thomas Scientific，目录号：1232X12）
旋转蒸发器（BüchiRotavapor R-134，BüchiWaterbath B-481）（Büchi，Flawil，瑞士）
玻璃漏斗（例如，，Duran，目录号：21 351 23）
多种尺寸的圆底烧瓶（5ml，10ml，25ml，50ml，250ml，1L）（例如Schott，德国）
钢弹簧夹（例如，，托马斯科学）
NS 14.5（例如，Thomas Scientific，目录号：1178Z55）
NS 29（例如，Thomas Scientific，目录号：1178Z57）
磁力搅拌棒（例如，Thomas Scientific，目录号：8608S78）
磁力搅拌器（Heidolph Instrument，目录号：505-30080-00）
玻璃瓶1升（例如，Thomas Scientific，目录号：1228R95）
具有不同长度和直径的玻璃色谱柱，底部带有旋塞，顶部具有接地插座接头以安装溶剂容器（例如，Neubert Glas，目录号：1196-29-20400）< br />
几种尺寸的玻璃烧杯（例如德国杜兰德国）
一件真空软管（例如，Thomas Scientific，目录号：9544T15）
溶剂储存器：具有相反连接的地锥和接地插座接头的几种尺寸的玻璃圆底烧瓶（例如，Thomas Scientific，目录号：1197C03）
适配器：
地面锥形接头NS 14.5，带有管道的管道，弯曲（例如，Thomas Scientific，目录号：1195C09）
接地锥形接头NS 29，带有管道的软管，弯曲（例如，LabMarket，目录号：1681029）
手动泵（VWR，目录号：612-9952）
125ml锥形瓶（例如，Thomas Scientific，目录号：4907F23）
试管架（例如，Thomas Scientific）
TLC室（螺帽玻璃罐，250毫升）
UV灯（254nm），例如UV灯4，双（Camag，型号：022.9160）
高真空泵（Alcatel Pascal 2015 SD）（例如，，Ideal Vaccum Products，目录号：P102310）
Cortecs ^TM具有Cortecs 的Cortecs 18mm，1.6μm，2.1×150mm（Waters，目录号：186007117） sup> TM UPLC ^> C 18>1.6μm，2.1×5mm VanGuard TM预柱（Waters，目录号：186008713 ）
Aquity ^TM Ultra Performance LC（Waters，Milford MA，USA）
Bruker maXis Q-Tof HR-MS（Bruker Daltonics，Bremen，Germany）
Eppendorf反渗透微量离心机（Eppendorf，型号：5417R）
MilliQ梯度仪（用于HPLC的去离子水）（EMD Millipore，目录号：Z00Q0V0WW）

程序

根皮提取
1. 在树荫下将根皮干燥30-35°C一周。
  注意：如果这不是您常规的环境温度，可以使用烘箱。
2. 用锋利的斧头细碎树皮，并用封盖的发酵罐中的MeOH（1：1，w/v）提取1周。每天搅拌混合几次。如果可能，请用机械搅拌器永久搅拌您的萃取混合物注意：在我们的例子中，提取是在环境温度（巴基斯坦30-35°C）的常规实验室条件下进行的。
3. 通过紧密编织的布过滤掉固体，并将旋转蒸发器上的MeOH在30℃和70毫巴下蒸发数小时，其中提取物变得高粘度。由于不可能完全除去MeOH，因此当不再可以观察到提取液中形成气泡时，停止溶剂的蒸发。
4. 将几乎黑色粘稠的提取物储存在4°C直至使用。
注意：在我们的实验中，我们用45升的MeOH提取45公斤根皮，得到215克黑色粘稠的提取物。
生物碱的色谱分离：一般程序
二氧化硅（SiO 2）上密码子香草型生物碱的色谱分离涉及至少四个色谱分离，遵循以下所有主要原理：
1. 样品在SiO 2上的吸附
  粗提取物和生物碱馏分在少量的MeOH中难溶，甚至在用于色谱的洗脱液中溶解性较差。然而，将提取物以尽可能小的体积应用到色谱柱上是非常重要的。因此，混合物在被带到柱上之前被吸附在SiO 2上。
2. 制备洗脱剂混合物和色谱柱
  1. 以干净的玻璃瓶将洗脱组分以给定的比例混合（表1-5）。在使用前蒸馏溶剂至关重要。
  2. 准备一列，如图2所示。
  图2.色谱柱的包装柱子是棉绒（A），海砂（B），SiO 2（C），附加海砂（D）和SiO 2（E）上的吸附样品。
3. 色谱分离
4. TLC分级控制
5. 馏分的组合和溶剂的蒸发
四种主要生物碱的色谱分离细节
注意：本部分详细描述了我们实验室的工作。为了改进分离，我们建议以下步骤：
1.从B列开始，进行粗糙的生物碱隔离（表3）。
2.根据B1栏（表4）的描述，将生物碱1和2/3与生物碱4分开。
3.将含有1和2/3的所有级分合并到一个样品中，并按A1.2所述进行色谱分析，以获得纯1和2/3（表2）。
4.如B1.4.1所述，用MeOH洗涤含有4的级分。
四种生物碱cadabicine（1,435Da），二十六烷酸（2,465Da），异香草香（3,465Da）和capparidisinine（4,495Da）具有非常相似的色谱行为。为此，我们在项目开始时获得了许多混合分数，原始提取物的初步色谱以及部分分离的馏分。为了分离1和2/3，我们开始使用通过这些级分中的几种组合获得的生物碱混合物（A1,576mg）。可以同样使用的预纯化生物碱级分也是级分B1，其用于分离capparidisine（4）。
1. 路径A：分离cadabicine（1）和codonocarpine（2）/异香草香（3）
  分离路径A在图4中示意性地示出。将各种初步色谱（A）的含生物碱的级分在A1中合并。 A1的色谱分离导致四个主要部分。其中三个含有不同比例的1和2/3的混合物（A1.1主要是1，A1.2可比量为1和2/3，A1.3主要为2/3）。第四部分（A1.4）主要含有生物碱4，还有2/3。由于所得到的级分均不含有纯生物碱，所以将样品A1.1和A1.3作为储备材料保存，并且在SiO 2上进一步分离最大级分（A1.2），得到生物碱1（A1.2.1）和2/3（A1.2.3），纯度高（> 98％）。
  不幸的是，A1.4部分不包含最终隔离纯4的材料。
  色度细节和结果总结在表1和表2中。在生物碱混合物的部分中，主要生物碱被加下划线。
  
  图4.分离路径A。概述了从生物碱混合物（A1）到纯卡巴肼（1，A1.2.1）的纯样品和密码子草酮和异柠檬酸的混合样品（2/3，A1.2.3），用于阐明其结构。混合部分中的主要生物碱被加下划线。
  
  表1. A1的色谱分离
  
  表2. A1.2的色谱分离
2. 路径B：Capparidisinine（4）的分离
  分离路径B在图5中示意性地示出。粗的甲醇提取物（B）在SiO 2上大致分馏，以将含生物碱的级分（B1）与进一步提取的物质分离。将生物碱混合物B1进行色谱分离，得到含有不同比例的1和2/3（B1.1-B1.3）和1份仅含有一种生物碱（4）的三种级分。部分B1.4中的生物碱4被一些未鉴定的Schlittler无活性化合物（通过1 H-NMR检测）污染。额外的色谱步骤（B1.4.1）不能将生物碱4与其污染物分离。最终通过用少量的MeOH洗涤样品B1.4.1来获得卡派里沙星（4，B1.4.1.1）。
  色彩细节和结果总结在表3-5中。在生物碱混合物的部分中，主要生物碱被加下划线。
  
  图5.分离途径B。概述从粗提物（B）到生物碱4（B1.4.1。）的色谱步骤，包括洗涤步骤，以获得纯形式的capparidisinine（4，B1 .4.1.1），其结构被阐明。混合部分中的主要生物碱被加下划线。
  
  表3. B的色谱分离
  
  表4. B1的色谱分离
  
  表5. B1.4的色谱分离
3. 进一步净化B1.4.1
  将B1.4.1（77mg）的黄色固体置于1.5ml Eppendorf管中，加入MeOH（0.3ml）。将混浊混合物小心摇动，然后离心（1分钟，20,817×g）。用吸管将黄色溶液与剩余的固体小心分离。将固体用MeOH洗涤三次（每次0.2ml）。将剩余的固体转移到圆底烧瓶中，真空干燥（30℃，160mbar，然后23℃，0.2mbar），得到明亮的黄色固体B1.4.1.1（4 ，15mg）。
转化为盐酸盐
1. 将生物碱悬浮于MeOH中。
2. 滴加1.5当量的水溶液HCl（0.1或1.0N）至浑浊溶液。解决方案变得清晰。
3. 真空蒸发溶剂（30℃，160毫巴，然后23℃，4×10 -4平方毫米）。

数据分析

HPLC-ESI-MS
1. 通过HPLC-ESI-MS分析生物碱级分。将样品溶于MeOH + 0.1％HCO 2 H，0.5ml/min，粗提取物和0.1mg ml -1重量份，用于纯化的生物碱。以1μl的体积注射样品，并在RP C 18+柱上以0.3ml/min的流速进行色谱分离，用溶剂A（H <亚O 2 + 0.1％HCO 2 H）和B（MeCN + 0.1％HCO 2 H）在25℃下反应。梯度开始于10％B等静5分钟，然后在4分钟内升至25％B。柱用100％B洗涤2分钟，然后在5％B下平衡6分钟
2. 连接的Q-Tof MS装有ESI源。在50-800m/z的正电离模式下，在以下条件下记录MS：HV端板偏移500V，HV毛细管3,000V，喷雾气体（N 2）2.0巴，干燥气体（N 2）10.0巴，干燥温度200℃。用2mM甲酸钠（980μlH 2 O/2-丙醇1:1,20μl0.1N NaOH和1μlHCO 2 H），相对质量误差通常低于2ppm（外部）
3. 用35.00eV的碰撞能量和4.00的隔离宽度记录MS/MS谱
4. 使用DataAnalysis评估色谱图和光谱。基于精确质量±0.02 m/z，提取萃取离子色谱图（EIC）。
例如，粗提物B的基峰色谱图（BPC）如图6所示。生物碱相关EIC如下所示。提取物含有三种形式的密码子型生物碱：（1）糖苷衍生物（2.3-2.7分钟），（2）（E/Z） - 衍生物（3/3），其可以是人工制品，和（3）主要（E/E） - 生物碱（R t） 4.2-4.4 min），用我们的方案分离。
虽然cadabicine（1）和capparidisinine（4）可以与HR-MS区别，但是对于密码子（2）和异香豆素（3）而言并不是这样。我们发现密码子（2）的保留时间（4.2分钟）比异香豆素（3，4.3分钟）略小。（2）和（3）的MS/MS光谱几乎相同。它们仅在m/z 218.08058处仅有一个低密度信号，这对于密码子（2）是唯一的。但要小心;两种化合物都显示在m/z 218.11713处的信号。
注意：有关MS/MS光谱和NMR光谱解释的详细讨论，请检查"卡帕斯藜甙的Codonocarpine类型生物碱的新视野"（Forster 等> ，2016）。

图6.粗提物的BPC和密码子类生物碱相关质量的EIC。粗提物含有三种不同形式的生物碱衍生物。所有（E/E）衍生物可以通过其确切的质量和保留时间来确定四种主要生物碱卡泊他奇（1），二十二烷酸（2），异香芹果（3）和卡帕立西定（4）。

笔记

我们发现储存密码子类生物碱的最稳定的形式是固体形式。因此，色谱后立即在旋转蒸发器上干燥级分。

食谱

Schlittler试剂（Schlittler和Hohl，1952）
将H 2 PtCl 6 N（1.0g，在H 2 O [6ml]）中的混合物，KI（22.5g， 2 O [225ml]），水溶液HCl溶液（1N，20ml）用去离子H 2 O 2稀释至总体积为1000ml
着色，
胺类：棕色，多种色调（黄 - 红 - 蓝灰色）
酰胺：亮黄色，其次是Ce（SO 4）2 ：棕色
Ce（SO 4）2< 2><><<> 将Ce（SO 4）2（10.0g）的浓度溶液将H 2 SO 4（55ml）用去离子H 2 O 2稀释至总体积为1000ml
着色，
胺（与Schlittler试剂一起）棕色
酰胺：（与Schlittler试剂一起）增强了Schlittler试剂的染色

致谢

我们非常感谢李博士博士在收购MS和MS/MS数据方面的大力支持，我们感谢巴基斯坦高等教育委员会（HEC）（1-8/HEC/HRD/2013/2582， PIN：IRSIP 23 Ps 48），为A. Ghaffar对苏黎世大学进行为期6个月的研究考察。

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