设备

显微镜：在装有旋转盘模块（Yokogawa，型号：CSU-W1-T3）的倒立式蔡司显微镜（Zeiss，型号：AxioObserver Z1）上进行植物成像
相机：ProEM + 1024B相机（普林斯顿仪器，型号：ProEM + 1024B）
目标：63x计划 - 消色差目标（数值孔径1.4，油浸）

注意：可以用任何共焦显微镜进行图像。我们在上面描述了用于拍摄下面可以下载的样品图像的显微镜设置（参见软件7）。

软件

ImageJ（ http://imagej.nih.gov/ij/）（Schneider等人，2012）（见注1）
注意：如果链接未打开，请在浏览器中复制粘贴地址。
用于ImageJ的SiCE斑点检测器
注意：下载用于ImageJ的SiCE斑点检测器Macro。转到 http：//www.ens-lyon。 fr/RDP/SiCE/METHODS.html ，右键单击SiCE的SpotDetector.ijm，然后选择"将链接另存为"。使用以下名称保存文件："SiCE SpotDetectorV3.ijm"。
ImageJ的小波A Trou插件（ http：//www.ens-lyon.fr/RDP/SiCE/METHODS_files/Wavelet_A_Trou.jar ）
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ImageJ的FeatureJ插件（ http://www.imagescience.org/meijering/software/featurej/）
注意：如果链接未打开，请在浏览器中复制粘贴地址。
XLstat（Addinsoft， https://www.xlstat.com ）。
R（R基金会， https://www.r-project.org/），Excel（Microsoft， https://products.office.com/）。
（可选）下载模板图片（ http：//www.ens -lyon.fr/RDP/SiCE/METHODS ）（见注2）。

程序

图像采集
下面描述的宏可以与任何类型的共焦图像一起使用，无论是用激光扫描共聚焦显微镜还是用旋转盘共聚焦显微镜。因此，您应该根据显微镜设置定义采集参数。请注意，对于定量成像，应使用针对低背景优化的检测器设置和无像素饱和度（Simon& et al。，2016）拍摄照片。为了比较的目的，我们建议对所有图像使用类似的共焦设置。曝光时间必须通过考虑到采集过程中的舱室运动来定义。太长的暴露可能会导致异常形状或多个相同细胞内颗粒的计数作为示例，使用上述设备部分中描述的旋转圆盘显微镜，我们通常使用以下设置：图像采集时间为200毫秒，激光功率为30％，EM增益为100，图像尺寸为1024 x 1024像素。
注意：根据显微镜的设置和标记线的强度，使用的设置可能会有很大差异。
插件安装（视频1）
1. 在ImageJ/plugins文件夹中复制Wavelet_A_Trou文件和FeatureJ插件。
2. 在ImageJ /宏文件夹中复制SiCE Spot DetectorV3.ijm文件。
3. 通过在插件>中选择它来安装SiCE点检测器宏。宏>>安装。 SiCE SpotDetectorV3应该出现在插件>宏>>下图。
  
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  视频1.安装Sice Spotdetector宏和相关插件的步骤
  
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设置单个图像分析的参数
单次图像分析（程序C）的目的是找到可以正确分割图像的最佳参数（ ie ，最佳参数，以图像中的所有[或大多数]隔室尽可能少的假阳性），然后在批处理模式下使用这些参数（程序D）。每个标记线具有不同的信号强度，粒度和信噪比。不可能预测什么是用于特定标记线的最佳参数。因此，这些参数必须根据经验确定每个标记线。 C中的过程允许测试一系列参数以使用输入图像来对抗分割结果（步骤C10）。大多数情况下，使用这些参数是经验性的，我们建议您探索不同的参数，以便为您的图像找到最佳设置（下面，我们提供一些我们发现的数字通常适用于计算拟南芥中的内体数量 root）。但是，这些参数中的一些直接取决于要分析的粒子类型，特别是大小和圆形度。可以使用可选步骤C3来估计粒子大小，但您也可以根据经验和旁路步骤C3尝试不同大小的参数。
1. 用ImageJ（或斐济）软件打开一个共焦图像，您可以在其中量化细胞内区室或模板图片的数量（见注2）。可以使用投影3D堆栈。但是，我们不建议使用可能产生伪像和/或掩盖某些粒子的存在的投影，因此我们建议使用批处理模式对Z-stack中的所有图像进行量化（参见过程D）。
2. 如果要使用缩放图像，请根据显微镜设置在"分析选项卡"中的"设置缩放"，否则直接进入步骤C3。
3. 使用ImageJ估算粒度（可选STEP，视频2）。使用直线工具通过几个隔间画一条线。然后，使用绘图轮廓工具（Analyze>绘图轮廓），并再次使用直线工具测量轮廓内的结构尺寸。测量几个小区和大座的区域大约在峰的底部（图1）。它将帮助您确定最大尺寸，最小尺寸和西格玛参数，这将对检测步骤有用（见下文步骤C8）。例如，参见图2，其示出了用上述显微镜装置获得的各个隔室的典型尺寸（参见设备部分）。
  
  图1. FIJI程序的快照，显示使用绘图轮廓和直线工具手动测量各个点状结构（步骤C3）。 A. FIJI主工具栏; B.测试图像窗口; C.放大（B）中的虚线方块，显示使用ImageJ的直线工具绘制在几个隔间上的红线。 D.沿红线的荧光图。隔室被识别为峰值，并通过在其底部的线条测量。峰值测量。
  
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  视频2.估计感兴趣区隔大小的步骤
  
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  图2.来自ImageJ程序的快照显示通过旋转磁盘显微镜捕获的不同细胞内区室的大小。 A. FIJI主工具栏; B.高尔基体，标记线是Wave18（W18）（Geldner等人，2009）。 C.高尔基体内室，标记线是Wave25（W25）（Geldner等人，2009）。 D.晚期内体区室，标记线是Wave7（W7）（Geldner等人，2009）。渥曼青霉素隔室使用PI3Kinase/PI4Kinase抑制剂渥曼青霉素（Wm，30μM，60分钟）治疗后，晚期内体（W7）融合到所谓的"渥曼青霉素区"（Jaillais等人，2006; Simon& em，et al。，2014; Simon等人，2016）。 F.BFA隔间。用真菌毒素BrefeldinA（BFA，50μM，60分钟）处理后，由内吞示踪剂FM4-64标记的内体聚集成所谓的"BFA隔室"（Geldner等人，2003; Geldner等人，2009）。 G.对于A至F所示标记的峰宽测量的汇总表。
4. 从插件启动SICE-Spot检测器宏>宏> SpotDetectorMacroV3（视频3）。
  
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  视频3.找到使用SiCE斑点检测器宏分割细胞内颗粒的最佳参数的步骤
  
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5. 取消选中批量模式开始单一图像分析。
6. 选择是否要使用缩放图像或未缩放图像，方法是选中/取消选中"缩放图像"框。缩放图像将提供以斑数/μm 2表示的结果，而非烫伤图像将提供以点/像素数量²
  表示的结果
7. 如果要手动绘制感兴趣区域，请取消选中自动ROI（注3）。
8. 选择参数（图2）
  前三个参数直接来自步骤C3。最小粒径，最大粒径和圆形将用于内置宏函数分析粒子（ https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html ）。尺寸超出所定义范围的粒子将被忽略。值以平方μm或正方形像素表示。圆形取决于隔间的形状，范围从0（无限长拉长多边形）到1（正圆）。典型地，可以使用0.5-5μm2和0.5-1圆形度检测拟南芥根系中的细胞内区室，例如内体，但是可以使用其他参数来量化更多细长的颗粒或更大的颗粒如BFA隔室）。
  1. 在共焦图像中，感兴趣的细胞内区室将在中心出现或多或少的具有较高荧光信号的圆形物体。通过高斯核的图像卷积通常足以分割它们。 Sigma参数对应于在高斯滤波方法中使用的分布的标准偏差（Lowe，2004）。调整Sigma将取决于单元格中的背景和对象大小，并且必须根据经验确定。
  2. 将应用于您的图像的高斯滤波可以从高斯"DoG"或高斯拉普拉斯算子的差异中选择。经典地，高斯滤波的拉普拉斯算子给出了允许大小测量的对象的最清晰的边界，而DoG过滤将在不同大小的发现结构或更高背景下更有效。
  3. 自动阈值对应于将应用于过滤图像（Triangle，Otsu和Huang）的方法/算法（有关此步骤的更多详细信息，请访问以下地址 http://imagej.net/Auto_Threshold ）。再次，您需要尝试这些不同的方法，从经验上找到最好的方法
    
    图3.来自ImageJ程序的快照显示参数步骤的选择。 A. FIJI主工具栏; B.测试图像窗口; C.选择SICE点检仪的参数选择窗口。
9. 选择所有参数后，单击"确定"继续进行分析。
10. 将显示分段隔间边界和原始荧光图像之间的合并图像，以评估过程的效率（图4）; ，它将帮助您评估您使用的参数是否最适合找到感兴趣的细胞内区室。 ROI将作为红色包围区域显示在原始图像上。单击"确定"，您可以返回到步骤C8修改参数并进行新的分析。
11. 重申步骤C6-C10，直到您找到最佳参数来分割图像中的细胞内区室，然后继续执行步骤C12。
12. 取消选中"不快乐"框，显示"图片名称"，"单元格区域"，"现货号码"和使用的参数的"摘要"表格。确定数据集的最佳参数之后，您可以重新启动批量模式分析的宏（见过程D）。
  
  图4.来自ImageJ程序的快照，显示单个图像分析的结果。 A. FIJI主工具栏; B.测试图像窗口。兴趣区域表示为红线。 C.使用以下参数的斑点检测结果：MinSize 0.5 MaxSize 99 circMin 0.5 circMax 1 Sigma 3滤波方法高斯阈值三角形的差异; D.使用以下参数进行斑点检测的结果：MinSize 1 MaxSize 99 circMin 0.5 circMax 1 Sigma 3滤波方法高斯阈值三角形的差异; D."结果摘要"表，显示了在不同条件下测试的斑点数量的量化，使用了定义在第1行的C和第2行的D中的参数。
批量图像分析
1. 从插件启动SICE-Spot检测器宏>宏> SpotDetectorMacroV3。
2. 选择源目录
3. 选择要保存合并图像的目标目录（参见步骤C10）（此文件允许您检查所有图像中的分段是否正确执行）。
4. 选择将用于分析图像的以前优化的参数。
5. 宏将对源目录中包含的所有图像执行Spot检测，并在Summary表中收集结果。该表格可以直接保存为Excel文件，也可以复制并粘贴到预先存在的表格中。

数据分析

当手动计数每个细胞的斑点数时，100个细胞通常计数在10至20个不同的根（Simon等人，2016）。我们建议在使用自动点检测时保持相似数量的独立根（10到20），最终将代表大约500到1,000个单元格。然而，因为可变性可能会根据使用的斑点和标记的类型而有所不同，我们建议先估计样品量。为此，量化少量样品上的斑点数量，并使用以下公式估算样品量：
n =（t x t）x（s x s）/（d x d）
哪里，
s是平均值的标准误差，
t是统计置信水平（1.96，从95％的置信区间的标准正态分布推断），
d是误差范围（0.05）。
建议生物一式三份。对于统计分析，根据样本分布（分别为高斯分布或不分配）选择参数或非参数测试。参数测试如Tukey的真实显着差异测试或非参数测试，如Kruskal-wallis测试或Dwass-Steel-Critchlow-Fligner程序，用于样品之间的多重比较可以使用XLstat软件（ http://www.xlstat.com/）或R软件（ https://www.r-project.org/），以便找出是否有明显的差异。图形表示可以使用R软件或excel软件（Microsoft， https：//产品）完成。 office.com/）。

笔记

SiCE SpotDetector宏与目前的ImageJ分布（截至2016年11月）一起使用。唯一需要的插件是Wavelet_A_Trou和FeatureJ。如果您有较旧版本的ImageJ并遇到宏问题，请重新安装最新版本的ImageJ（ http://imagej.nih.gov/ij/）。
要测试宏，可以下载示例图像（ http：//www.ens-lyon.fr/RDP/SiCE/METHODS ）（以像素为单位设置缩放比例：4.8473，已知距离：1，像素长宽比1.0，单位长度：μm）。
该方法将使用基于小波的图像分割来自动检测图片中的根。它将选择图像中的整个根，或选择具有最高信号的根部分。宏选择每个图像只有一个连续区域。这将允许宏只在具有最高信号的区域中量化隔离区，在根部标记不均匀的情况下。如果要量化相同根部的几个区域，标记强度有显着差异，请根据这些不同的区域裁剪图片，或使用正常模式并手动定义投资回报率。

致谢

感谢Laia Armengot（RDP，ENS里昂）对手稿的批评性意见，Erik Meijering（伊拉斯姆斯大学医学中心，荷兰鹿特丹）开发FeatureJ。 Y.。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。

参考文献

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