材料和试剂

E。大肠杆菌DH5a和根癌土壤杆菌菌株GV3101
pRS316-RGR-GFP质粒（Addgene，目录号：质粒51056）
pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒
引录（表S1 ）< br />
吉布森装配试剂
您可以从（New England Biolabs，目录号：E5510S）购买商品包，或者使用以下各种试剂制备您自己的商品：

5x等温（ISO）反应缓冲液（25％PEG-8000; 500mM Tris-HCl，pH7.5; 50mM MgCl 2）; 50mM DTT; 4mM dNTPs中的1mM; 5mM NAD）
T5外切核酸酶（Epicentre，目录号：T5E4111K）
Phusion DNA polymerase（New England Biolabs，目录号：M0530L）
Taq DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0208L）

Phusion高保真PCR试剂盒（New England Biolabs，目录号：E0553L）
LB培养基
合适的抗生素
QIAGEN质粒迷你套件
Mfe I/I（New England Biolabs，目录号：R0589S）
10x CutSmart ^®缓冲区
T7，SP6或T3 RNA聚合酶与转录缓冲液对于SP6/T7（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1320）
对于T3（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM1316）}}
5x转录缓冲液
1 M DTT（Thermo Fisher Scientific，目录号：P2325）
20 U /μlRNA酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：N8080119）}
10mM NTP混合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：18109017）}
rNTPs
无机焦磷酸酶
EDTA
12％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶
溴化乙锭

设备

37℃水浴（温度控制水浴）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1660524）
热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，型号：Applied Biosystems} 2720，目录号：4359659）
DNA电泳装置（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^TM基本电源，目录号：1645050EDU）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
紫外透射仪（Bio-Rad Laboratories，型号：UView ^TM迷你透射仪，目录号：1660531）

程序

设计，组装和克隆RGR（核酶-GRNA-核酶）单位
我们设计一个名为"RGR"的人造基因，其主要成绩单位于两端的核酶两侧（图1）（Gao和Zhao，2014）。

图1.核酶侧翼gRNA（RGR，核酶-RNA-核酶）分子的示意图。一旦转录，相应的RGR DNA将在5'末端产生具有核酶的RNA分子， - 和3'末端。主要转录本将经历自我裂解以释放成熟的gRNA。 RGR设计允许从任何启动子生产功能性gRNA分子，使得能够在体外体内和/或组织/细胞特异性方式产生gRNA分子。 />
1. 设计核酶-RNA-核酶（RGR）单位
  1. 如果适配器序列为 XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX （上游适配器）和 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY （下游适配器），请设计两个正向引物和一个反向引物，如下所示。包括X和Y的适配器序列为您的线性化矢量提供必要的重叠序列，以便RGR单元可以通过吉布森装配原理组装成向量。衔接子序列的长度根据实际序列而有所不同，但通常17 bp至24 bp的值足够大，只要T值高于50°C。
    1. 为您选择的载体设计通用的RGR反向引物：UNIVERS-RGR-R： ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ GTCCCATTCGCCATGCCGAAGC 。 UNIVERS-RGR-R引物应与GCTTCGGCATGGCGAATGGGAC 反向互补，其中 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY 是下游衔接子序列（Y和Z是反向互补的）。斜体序列与HDV核酶的3'末端互补。
      
      图2. RGR单元的分子设计和通过PCR组装完整的RGR单元。顶部图显示了产生靶向（N）^{的gRNA的RGR单元的完整序列20 序列。带下划线的序列是来自载体的衔接子序列，用于将RGR单元克隆到最终的CRISPR载体中。请注意，如果选择不同的载体，衔接子序列将相应变化。 N ¹至N ^{20（红色）是NGG PAM位点之前的靶序列。重要的是，M ⁵ M ⁵ M ³ M ² M ¹和N <1>} N ^{N ³ N ^{N ⁵ N ^{6反向互补，使得核酶可以如所设计的那样进行自我切割。以绿色突出显示的序列是核心gRNA序列。以黄色突出显示的序列是锤头核酶。 HDV核酶以紫色突出显示。引物用不同的颜色标记：黑色（Gene-RGR-F1），浅蓝色（Gene-RGR-F2）和红色（UNIVERS-RGR-R）。通用引物取决于载体序列，如果使用不同的载体，则需要改变。完整的RGR单元可以通过两次重叠PCR反应轻松组装。}}}}
2. 组装核酶-RNA-核酶（RGR）单位
  1. 用于靶向新基因的RGR单元通过两轮重叠PCR反应进行组装（图2）。两个正向引物之间存在21-bp重叠（图2）
  2. 第一次PCR（PCR1）：使用引物对GENE-RGR-F2 + UNIVERS-RGR-R。模板：任何现有的RGR构建体（例如，pRS316-RGR-GFP，可从 Addgene ，预期PCR产物为233 bp）
  3. 第二轮PCR（PCR2）：使用引物对GENE-RGR-F1 + UNIVERS-RGR-R。使用PCR1凝胶纯化的PCR产物作为模板。预期的PCR2产物是277bp，这是完整的RGR单元（图2）。
  根据制造商的建议（ https://www.neb.com/protocols/1/01/01/pcr-protocol-m0530 ）。简言之，如表1所述混合PCR组分。
  
  表1.用于扩增RGR单位的PCR设置
  
  表2.扩增RGR单位的PCR条件
3. 将最终的RGR产物连接到所需的载体中 - 克隆RGR（核酶-GRNA-核酶）单位
  
  通过两轮PCR组装的完整的RGR单元使用 Gibson汇编协议（Gibson等人，2009）。注意，PCR引物GENE-RGR-F1和UNIVERS-RGR-R含有与载体中的序列的一部分相匹配的序列，以促进RGR单元在载体中的组装（图2 ）。
  1. 在50℃孵育DNA组装混合物（表3）1小时。按照制造商推荐的方案进行DNA装配（表3）。（ https：//www.neb .com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix＃tabselect2 ）。
    
    表3. DNA组装
  2. 然后将3μl连接的产物转化成E。大肠杆菌DH5α感受态细胞。
    连接的质粒可以转化到E中。常规克隆程序后的大肠杆菌感受态细胞（Sambrook和Russell，2001）。
  3. 在将最终质粒引入您选择的细胞/生物体之前，通过Sanger测序验证阳性克隆（Yoshioka等人，2015）。
构建CRISPR介导的基因编辑的RGR单元的一个例子
1. 选择一个靶基因和一个载体
  我们展示以"拟南芥"为基础的RGR单元的构建以生物素结合蛋白1（ABP1）（图3）为例（Gao等， em>，，2015）。我们使用pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒作为我们的CRISPR载体（Gao等人，2016），其已被用于在拟南芥中编辑基因质粒可以通过 Addgene 获得。
2. 线性化质粒
  我们用Mfe I消化pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒（图3）。通过Gibson装配将MGRI-linearized质粒用于将RGR单元组装到载体中。完整的质粒可以从植物中的拟南芥UBQ10启动子表达ABP1-RGR单元（图3）。
  
  表4.通过限制消化
  对向量进行线性化
  
  混合表4所示的组分，并在37℃下消化载体过夜。然后将酶在80℃加热灭活15分钟。线性化质粒为16084 bp。
3. 设计PCR引物
  上游转接器序列是GTTTTTCTGATTAACAGCTCGC。我们使用的下游适配器是GACCTAACTGAGTAAGCTAGC（图3）
  1. 正向引物1：ABP1-RGR-F1：
    GTTTTTCTGATTAACAGCTCGC AGCTCC CTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGAGTAAGCTCGTC 。粗体的6bp序列与gRNA靶的前6bp反向互补。下划线的序列是Hammerhead核酶的一部分。
  2. 正向引物2：ABP1-RGR-F2：
    GACGAAACGAGTAAGCTCGTC GGAGCTCCTTGTCCCATCAA GTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 。下划线序列是Hammerhead核酶的一部分。粗体字是gRNA靶序列，斜体序列是核心gRNA序列的一部分。
  注意：ABP1-RGR-F1中的粗体序列与ABP1-RGR-F2中的粗体序列的前6bp反向互补。 ABP1-RGR-F1和ABP1-RGR-F2共享以下重叠序列：GACGAAACGAGTAAGCTCGTC，其允许我们进行两个重叠的PCR反应。
4. 为了使用Gibson装配将ABP1-RGR单元克隆到35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒中的MfeI I位点，UNIVERS-RGR-R引物是：
  GCTAGCTTACTCAGTTAGGT C GTCCCATTCGCCATGCCGAAGC
  注意：粗体序列与下游适配器序列互补。斜体序列与HDV核酶的3'末端相符。
5. 用于产生靶向ABP1基因的gRNA的完整的RGR单元显示在图3中.RGR单元导致在中成功分离了几个无效等位基因的abp1 拟南芥（高等等，2015年和2016年）。
  
  图3.用于靶向拟南芥中ABP1基因的RGR单元的分子设计。将RGR单位克隆到pHDE-35S-Cas9-mCherry-UBQ质粒中使用Gibson程序集的Mfe I站点。适配器序列带下划线。注意，当设计通用引物时，下游衔接子序列必须转换为反向互补序列。目标序列为红色。 Hammerhead核酶和HDV核酶分别以黄色和紫色突出显示
通过体外转录导向RNA的生成
一旦RGR单元被组装并克隆到如上所述的最终载体中，可以使用可商购的T7，SP6或T3 RNA聚合酶通过体外转录来容易地产生gRNA。
1. 为体外准备DNA模板转录
2. 转录
将RGR质粒转化成拟南芥
通过土壤杆菌介导的花浸法（Clough and Bent，1998）将具有RGR构建体的最终质粒转化到拟南芥中。将转基因T1植物鉴定为抗潮霉素或产生mCherry荧光（Gao等人，2015和2016）。使用PCR和限制性消化筛选T1植物进行编辑，如Gao等人，2015和2016所述。

数据分析

我们基于RGR的功能性gRNA的生产在体外和体内成功（Gao和Zhao，2014; Gao等人， 2015年和2016年）。我们最初使用RGR设计产生了靶向GFP的gRNA。使用市售的SP6 RNA聚合酶从SP6启动子体外产生gRNA（Gao和Zhao，2014）。消化测定表明gRNA是完全功能的（Gao和Zhao，2014）。我们使用相同的RGR设计，使用ADH启动子RNA聚合酶II启动子（Gao和Zhao，2014）在酵母中产生gRNA。这样的结构导致在酵母中成功地编辑了GFP 基因。我们进一步在拟南芥中引入了RGR设计以产生靶向拟南芥ABP1基因的gRNA。已经获得了ABP1基因中的多个稳定的可遗传突变（Gao等人，2015和2016）。例如，我们制作了一种使用RGR进行一个gRNA生产的构建体，并且U6启动子产生另一个gRNA。两个gRNA分子靶向拟南芥中ABP1基因的两个离散位点，并设计为产生771bp的缺失（Gao等人， 2016）。我们检测到61个T1植物中有5个的预期缺失。两个T1植物在T2代产生了无Cas9的稳定的纯合突变体（Gao等人，2016）。
RGR设计已经适应于编辑其他生物体中的基因（Nissim等人，2014; Yoshioka等人，2015）。

致谢

该协议最初在加州大学圣地亚哥分校开发，当时YG是研究生。华中农业大学的议案进一步完善。作者要感谢国家基因转化授权＃2016ZX08010002-002至RW和NIH授权R01GM114660至YZ的支持。

参考文献

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Gao，X.，Chen，J.，Dai，X.，Zhang，D. and Zhao，Y。（2016）。可靠地分离由CRISPR/Cas9介导产生的遗传和Cas9 -free 拟南芥突变体的有效策略基因组编辑。植物生理学 171（3）：1794-1800。
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Sambrook，J.and Russell，DW（2001）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.mendeley.com/research/molecular-cloning-laboratory-mannual-3rd-ed/"target ="_ blank"> Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed。 Cold Spring Harbor Laboratory Press pp：1105-1111。
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