材料和试剂

5ml管
无针注射器
双刃刀片（Electron Microscopy Sciences，Personna ^TM，目录号：72000）
玻璃盖玻片，1.5号（VWR，目录号：16004-302）
解剖针或探头针
培养皿（VWR，目录号：25384-302）
离心管（VWR，目录号：89039-668）
0.45μm过滤器（VWR，目录号：28145-481）
一次性转移移液器（Fisher Scientific，目录号：13-7117M）
玻璃滑梯（VWR，目录号：48300-048）
拟南芥叶/花/茎组织（Ecotype Col-0,6周龄植物）
Lurie肉汤
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
孵化解决方案
磷酸氢二钾（K 2/2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
硫酸铵（NH 4）2 SO 4（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）
柠檬酸钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C8532）
硫酸镁（MgSO 4）（1M储备溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
KOH或NaOH
氨基丁酮（3'，5'-二甲氧基-4'-羟基苯乙酮）（Sigma-Aldrich，目录号：D134406）
MS中等基础盐（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
纤维素酶'onozuka'R-10（Yakult Honsha，Tokyo，Japan）
Macerozyme R-10（Yakult Honsha，Tokyo，Japan）
甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M1902）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
氯化钙滴液（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C7902）
BSA（可选）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
感应介质（见配方）
渗透介质（见食谱）
纤维素酶/macerozyme溶液（参见食谱）
洗涤和孵化溶液（WI）（参见食谱）

设备

387/478/555 nm三通带滤波器激发与宽发射滤波器〜400-700 nm
LED照明，488nm，543nm（Lumencor AURA光引擎）
孵化器摇床
平台摇床
镊子（VWR，目录号：82027-440）或（Cole-Parmer仪器，目录号：EW-07287-09）
90i立式复合显微镜（尼康仪器）
10x Plan Apo 0.45NA（Nikon Instruments，型号：OFN25）
20x Plan Apo 0.75NA（Nikon Instruments，型号：lambda）
60x Plan Apo VC水浸镜头1.2NA（尼康乐器，型号：MRD07602）
共焦激光扫描显微镜（CLSM）（尼康仪器，型号：A1 ⁺）
高压灭菌器
水浴
真空干燥器

软件

NIS-Elements软件

程序

农杆菌介导烟草叶片的瞬时转化
1. 培养在农杆菌菌株C58C1中携带目的基因的目标基因在5升Lurie肉汤培养基中在30℃下在孵育振荡器中过夜并以1,000×g旋转。
2. 将细菌细胞转移到5ml的诱导培养基中（参见食谱），并在30℃振荡培养16小时。
3. 旋转细胞并重新悬浮在1ml渗透培养基中（见食谱）。
4. 在新鲜的5ml管渗透培养基中，在600nm处测量细菌浓度至0.8的光密度。渗透大约4周龄烟草植物的青叶，烟草烟草 cv。 xanthi使用无针注射器。 48小时后可视化植物表达。
注意：修改自Van den Ackerveken等人的协议（1996）。
拟南芥植物样品的制备
1. 当通过与488nm LED耦合的宽发射滤光片通过眼睛观察时，GFP或YFP将不仅允许GFP或YFP的可视化（具有较少的激发效率），而且还可以显示质体。这种全频谱可视化允许用户区分质量从红色发射到橙色的损坏区域。此外，在杂色组织中，眼睛观察可能是区分低GFP或YFP和损伤/应激区域的唯一方法。眼睛观察具有更深的光学部分的优点，为本地化提供了上下文。在这种情况下，10x和20x可视化提供了追踪血管定位的线索。
2. 用广泛的发射滤光器显示的543nm光激发的RFP将在质体的红宝石红色背景中显现深橙色。由于RFP表达低，难以区分两者，CSLM应用于分离两者。
3. 将LED用于更常见的汞蒸气灯的好处是减少了漂白或质子颜料的降解，这会导致发生错误分析的排放。
酶消化的植物组织和可视化的准备
部分酶促消化。 thaliana 留下植物脉管系统中荧光的可视化。酵素消化是通过修改Yoo等人的方案进行的。（2007）用于原生质体隔离程序。
1. 切开叶子，使大部分叶片从中脉和静脉中剪下来，并进行酶消化。
  注意：本实验通常使用6至7周龄的植物。
2. 将待消化的植物材料放入含有酶溶液的培养皿中，并放入真空干燥器中，真空渗透15分钟。
  注意：5-10毫升的纤维素酶/巨噬菌体溶液（参见食谱）对于开花的拟南芥植物来说是足够的。
3. 从真空中取出培养皿，并在平台摇床上，在30-50RPM之间，在室温下继续消化2小时。
4. 当表皮被消化时，适当的消化时间接近，叶肉细胞开始脱落。产生的浆液用完整的叶观察血管薄壁，或者当样品不能完全消化到原生质体阶段时，可以用转移移液管或细尖镊子容易地转移。样品可以转移到含有10ml WI缓冲液的培养皿中。在复合显微镜上，如果可以看到脉管系统，样品就可以进行共聚焦分析了。脉管系统容易通过木质部的螺旋增厚识别，透射光为10x或20x。消化时间将随着植物材料的耐受性而变化。
5. 载玻片上的样品用盖玻片共聚焦显微镜。孵育溶液用于安装样品，因为它将在成像期间支持细胞。

数据分析

影响样本观察的因素：

转基因结构特征影响显微镜结果
启动子选择可以在我们的实验中显着影响信号强度。因此，我们将瞬态，高水平表达实验与天然启动子相结合，对待测试的任何构建体进行稳定转化实验（图4）。对于靶向亚细胞器的蛋白质，看来全长基因的截短有时会产生不可靠的结果。图5显示，仅当蛋白质编码区的至少区域I-III包含在分析中时，可以发现靶向质体的核苷酸亚室的MSH1蛋白定位于核型（Virdi等人。，2016）。

图4.叶中的表达模式和表达水平根据所使用的启动子而变化。 A.烟草中的pCAMBIA1302C :: 35S :: MSH1 :: GFP瞬时表达。当基因构建体由CaMV 35S启动子驱动时，有更多的点状GFP表达信号。 B.pCAMBIA1302C（-35S）:: NativePro :: MSH1 :: GFP稳定表达在拟南芥细胞中。天然启动子导致较少的点状GFP信号（如通过质体数量的绿点所见）。所有比例尺为25μm。 GFP伪着色 - 绿色，叶绿体自发荧光假染色 - 红色，最大强度预测。

图5.蛋白定位模式可以根据拟南芥Col-0叶组织中的截短而变化。 A。天然启动子:: MSH1（ATG到结构域I）:: GFP;单独的域I在质体中产生扩散信号。单帧图像B.原生启动子:: MSH1（ATG到结构域III）:: GFP。单帧图像C.原生启动子:: MSH1（ATG到域V）:: GFP。 MSH1 ATG开始到域III是必要的，以进行点状定位。最大强度投影。 GFP假绿色，叶绿体自发荧光伪染红色为所有图像。所有比例尺为25μm。 D.用于截断研究（Virdi等人，2016）的拟南芥MSH1的不同结构域的示意图。
组织制备也可以影响共聚焦显微镜研究中的分辨率在其天然启动子控制下用全长基因构建体稳定转化的植物提供记录空间和时间表达行为的机会。图6显示部分组织消化的结果，揭示MSH1蛋白在血管薄壁组织的特殊质体中的定位。在图7中，这些观察结果通过在血管束组织中显示MSH1-GFP信号的干细胞横截面得到证实。然而，测定的组织不是来源于应激植物是重要的。图8显示植物在胁迫下的人为荧光可能与RFP信号混淆

图6.部分酶消化。拟南芥叶中脉和侧脉，研究荧光的亚细胞定位。 Native Pro :: MSH1 :: GFP稳定转化A。如上所述，用纤维素和macerozyme消化Col-0。 MSH1 :: GFP特异性质体中的表达可以看作是围绕韧皮部和木质部，而不是在叶肉中。所有比例尺为25μm。 A.小叶静脉GFP伪着色 - 绿色，叶绿体自发荧光假染色 - 红色，木质部自发荧光假染色 - 蓝色。最大强度投影。 B.叶中。 GFP伪着色 - 绿色，叶绿体自发荧光假染色 - 红色。

图7.用于显示蛋白质组织特异性的手工分割技术。 A.天然启动子的横截面:: MSH1 :: GFP稳定转化的花茎手部分如材料和方法中所述。 MSH1 :: GFP表达定位于血管系统。 GFP假绿色，叶绿体自发荧光假染色红色，木质部自发荧光假绿色在GFP通道中具有串扰。 B.双重变换的横截面。具有MSH1 :: GFP和PPD3 :: RFP（AT1G76450）的拟南芥;两种蛋白质在同一组织和质体型中的共定位。 GFP伪着色 - 绿色，RFP伪着色 - 红色，叶绿体自发荧光假染色 - 蓝色。单幅图像和所有比例尺均为25μm。

图8.用户需要在共聚焦显微镜中注意的人工制品。 A。拟南芥 Col-0叶空泡。刻度棒为25μm。叶绿体自发荧光假绿色，液泡自发荧光假绿色 - 红色。最大强度投影。

食谱

感应介质（1L）
10.5g K 2 HPO 4
4.5g KH 2 PO 4
1g（NH 4）2 SO 4
0.5克柠檬酸钠二水合物 1ml MgSO 4（1M储备溶液）
2 g葡萄糖
5毫升甘油
10 mM MES
用KOH或NaOH将pH调节至5.6，并在115℃下高压灭菌20分钟冷却培养基并加入抗生素和50μg/ml乙酰丁香酮
渗透介质
半强度MS中等基础盐
10 mM MES
用KOH调节pH至5.6 使用前加入150μg/ml乙酰丁香酮
纤维素酶/macerozyme溶液
1.5％纤维素酶'onozuka'R-10（0.15g/10ml）
0.4％macerozyme R-10（Yakult Honsha，Tokyo，Japan）（0.04g/10ml）
0.4M甘露醇（0.8M甘露醇储备液）
20mM KCl（2M KCl原料）
20mM MES，pH 5.7（0.2M MES储备）
将酶溶液在55℃的水浴中在15ml离心管中加热10分钟（不需要搅拌）
将其冷却至室温
加入10mM CaCl 2（1M CaCl 2）原料）; 0.1％BSA（可选）（10％储备，无菌）
将酶通过0.45μm过滤器
洗涤和孵化溶液（WI）
0.5 M甘露醇
4 mM MES，pH 5.7
20 mM KCl

致谢

为了演示，我们要感谢Kamaldeep Virdi博士和Sunil Kumar博士提供他们在拟南芥研究中的图像。我们也感谢Cecil Renfro对摄影的帮助。我们非常感谢能源部基础能源科学办公室（DE-FG02-10ER16189）的化学科学，地球科学和生物科学部门向S.M.提供支持。为这项工作。

参考文献

Baginsky，S.和Gruissem，W.（2004）。叶绿体蛋白质组学：潜力和挑战。 J Exp Bot 55（400）：1213-1220。
Van den Ackerveken，G.，Marois，E.and Bonas，U.（1996）。识别细菌无毒素蛋白AvrBs3发生在宿主植物细胞内。细胞 87（7）：1307-1316。
Virdi，K.S，Wamboldt，Y.，Yu，J.，Laurie，JD，Kumar，S.，Kundariya，H.，Xu，Y.，Elowsky，C.，Basset，G.，Bricker， Leubker，S.，Keren，I。和Mackenzie，SA（2016）。 MSH1是精确空间调节的植物细胞器DNA结合和类囊体蛋白以改变发育。分子植物 9：245-60。
Xu，YZ，Arrieta-Montiel，MP，Virdi，KS，de Paula，WB，Widhalm，JR，Basset，GJ，Davila，JI，Elthon，TE，Elowsky，CG，Sato，SJ，Clemente，TE and Mackenzie，SA （2011）。 MutS HOMOLOG1是一种核型蛋白，可以改变线粒体和质体属性和植物对高光的反应。植物细胞23：3428-3441。
Yoo，SD，Cho，YH and Sheen，J.（2007）。 拟南芥叶肉原生质体：用于瞬时基因表达分析的多功能细胞系统。 Nat Protoc 2（7）：1565-1572。 >