材料和试剂

乳胶手套（NIPPON Genetics，目录号：SLPF-M）
滤纸（3 MM CHR）（GE Healthcare，目录号：3030-909）
纸巾（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：47000）
实验室繁殖小鼠
注意：对于测试，应使用雄性小鼠避免发情周期的影响。小鼠以每笼3-5个饲养，保存在受控温度（〜23℃）和12小时光/黑暗循环（8:30 AM点亮）下的湿度，随意获取食物和水
2,4,5-三甲基噻唑（nTMT）（7.9M）（Tokyo Chemical Industry，目录号：T1068）
注意：已知狐狸粪便组分TMT（2,5-二氢-2,4,5-三甲基噻唑啉）在啮齿动物中引起天生的恐惧反应（Kobayakawa et al。，2007; Kaneko-Goto et al。 2013年）。非脱氢TMT（nTMT）也诱导类似的冷冻和回避反应（Takahashi等，2016）。
70％乙醇

设备

测试笼（31 x 21 x 12.5 cm）（每个鼠标一个笼子）
具有与测试笼相同尺寸的习惯笼（每个鼠标四个笼）
透明丙烯酸板（可覆盖测试笼的屋顶）
摄像机（Sony，目录号：HDR-CX560V）
注意：在弱光条件下记录鼠标行为。该型号（Sony Nightshot摄像机）配备了红外模式。
三脚架相机（SLIK，目录号：F 740）
红灯
通风柜

软件

Microsoft Excel（Microsoft）

程序

考试日之前
1. 在测试前五天，小鼠习惯于实验条件，实验者用乳胶手套处理它们。相同的实验者在连续五天内每天轻轻地处理每只小鼠10分钟。
在测试日（图1）
1. 在测试室中的12小时光/暗循环的暗相期间进行测试，其中弱红光（<5勒克斯）用于间接照明。将个体小鼠从他们的家笼转移到习惯室中的每个习惯笼。小鼠在习惯性笼中习惯于实验环境30分钟（习惯阶段）。我们建议在专门的室内进行测试，这是不同于习惯的房间，因为防止老鼠在测试前遇到nTMT是很重要的。
2. 每只老鼠从一个旧的笼子转移到一个新的习惯。对于每只动物，这种习惯过程重复四次（每个小鼠使用四个习惯笼，总共2小时）（习惯阶段;图1A，上）。
3. 在测试室中设置测试笼和数码摄像机。在笼子的一侧放置一张滤纸（2 x 2厘米）。用丙烯酸板覆盖测试笼的屋顶，以防止气味扩散，鼠标从测试笼中逸出（图1B）。
4. 在测试笼中的滤纸上滴下0,0.4,4和40μl量的未稀释的nTMT。
5. 将鼠标转移到测试笼后，在10分钟测试（测试阶段;图1A，底部）中记录摄像机的行为。
6. 被测试的鼠标返回到他们的家笼。一次测试结束后，使用nTMT香味的笼子和滤纸应保存在通风橱中（见注4）。使用新的测试笼和另一只鼠标开始下一个测试。
7. 录制的视频将被分析，如下所述。
  
  图1.嗅觉回避测试 A.实验程序的模式;嗅觉回避试验装置。

数据分析

使用录制的视频在10分钟测试期间手动测量冻结和回避时间。 “冻结时间”定义为除呼吸之外，时间保持3秒以上（图2A和视频1）。 “避免时间”被定义为在没有nTMT的香烟的区域内花费的时间，当测试笼分成两个相等的区域时。避免行为由回避指数（避税指数= [P - 50] / 50）表示，其中P是10分钟测试期间回避时间的百分比;图2B）。我们建议通过盲目分析来测量冻结和回避时间。
使用Microsoft Excel通过Welch t 测试来计算价值，其中您单击数据分析并执行 t -test：双样本假设不平等的差异对于多个成对比较，然后根据Holm-Bonferroni方法（Holm，1979）依次评估P 值，以手动方式保持实验α≤0.05。
评估Holm-Bonferroni方法的公式如下：
α/（n-k + 1）
哪里，
n：测试次数，
k：对的排名数。
Holm-Bonferroni校正示例：
考虑具有未调整的P - 值（p 1-4 ）的四个零假设（H 1-4），以显着性水平α = 0.05。 H 1：p 1 = 0.01，H 2：p 2 = 0.003，H 3 ：p 3 = 0.03，H 4：p 4 = 0.04

将 P - 值从最小到最小。
p <2>（= 0.003）＆lt; p <1>（= 0.01） p <3>（= 0.03） p 4 （= 0.04）
为了计算调整后的alpha水平，将Holm-Bonferroni公式用于第一级，并将其与排名第一的P 值（p 2 ）进行比较。如果 P 值较小，则拒绝第一排零假设（H 2 ）。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-1 + 1）= 0.0125
0.0125 p <2>（= 0.003）。 H 2 被拒绝。
对第二级重复Holm-Bonferroni公式，并将其与第二级的P 值（p 1 ）进行比较。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-2 + 1）= 0.0167
0.0167＆gt; p <1>（= 0.01）。 H 1 被拒绝。
对第三级重复Holm-Bonferroni公式，并将其与排名第三的P 值（p 3 ）进行比较。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-3 + 1）= 0.0250
0.0250 < p <3>（= 0.03）。 H <3>不拒绝。
当您达到第一个未被拒绝的假设时，测试停止。所有后续假设都不重要。我们得出结论，H 1和H 2被拒绝，H 3和H 4不被拒绝。 />

图2.嗅觉回避试验的样本数据。 A和B.野生型小鼠的冷冻时间（A）和避免指数（B） C.当使用较低量（4μl）的nTMT时，与野生型小鼠相比，5T4敲除小鼠显着降低了冷冻时间（参见Takahashi等人的详细信息， em>。，2016）。

Video 1. Freezing response in wild-type mice for 40 μl nTMT

笔记

对于这个测试，只能使用鼠标一次，以避免数据混淆，这取决于学习和记忆
实验者必须限制嗅觉强烈的气味产品，并在测试过程中产生过大的噪音。因为很难彻底清除实验者的个人气味，所以建议在测试之前处理老鼠的同一个实验者在整个测试过程中执行所有的过程。
因为在这个测试中使用了未稀释的气味，所以防止测试室气味扩散很重要。 nTMT瓶及其衍生物应保存在通风橱中。一次测试完成后，使用nTMT香味的笼子和滤纸应保存在通风橱中。在测试中，首先应使用较少量的nTMT，与较大量相比较。我们建议在专门的室内进行测试，这是不同于习惯的房间，因为防止老鼠在测试前遇到nTMT是很重要的。
实验者的存在以显着的方式影响小鼠的行为。实验者必须离开测试笼。我们建议当测试阶段从专用测试室开始时，实验者就可以到那里。

致谢

该方案从以前的研究（Kobayakawa等人，2007; Kaneko-Goto等人，2013）中被采用。（B）（AT），（C）（HT）和创新领域（自适应电路转换）（AT）和挑战性探索性研究（AT）的科学研究资助计划的支持日本教育，文化，体育，科技部（MEXT）。

参考

Holm，S。（1979）。一个简单的顺序拒绝多重测试程序。 Scand J Statist 6（2）：65-70。
Kaneko-Goto，T.，Sato，Y.，Katada，S.，Kinameri，E.，Yoshihara，S.，Nishiyori，A.，Kimura，M.，Fujita，H.，Touhara，K.，Reed，RR和Yoshihara，Y。（2013）。 Goofy坐标嗅觉信号的敏锐度。 J Neurosci 33（32）：12987-12996。
Kobayakawa，K.，Kobayakawa，R.，Matsumoto，H.，Oka，Y.，Imai，T.，Ikawa，M.，Okabe，M.，Ikeda，T.，Itohara，S.，Kikusui， Mori，K。和Sakano，H。（2007）。小鼠嗅球中的先天性与学习气味处理。自然 450（7169）：503-508。

Takahashi，H.，Ogawa，Y.，Yoshihara，S.，Asahina，R.，Kinoshita，M.，Kitano，T.，Kitsuki，M.，Tatsumi，K.，Okuda，M.，Tatsumi， Wanaka，A.，Hirai，H.，Stern，PL和Tsuboi，A.（2016）。气味检测和歧视行为需要嗅球中间神经元的亚型。 J Neurosci 36（31）：8210-8227。 >