材料和试剂

乳胶手套（NIPPON Genetics，目录号：SLPF-M）
纸巾（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：47000）
过滤提示
10μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1252-207CS）
200μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：1252-703CS）
1,000μl（FUKAEKASEI和WATSON，目录号：124-1000S）
实验室繁殖小鼠
注意：小鼠按每个笼子3-5个容纳，保存在具有受控温度（〜23℃）和12小时光/黑暗循环（8:30 AM点亮）的湿度的空间中，随意获得食物和水。
丁香酚（6.3M）（Nacalai Tesque，目录号：15806-42）
70％乙醇

设备

嗅觉仪表有两个通道（松井久久Ke）
气瓶（正常空气）
测试笼（25 x 37 x 24厘米，聚丙烯）
透明丙烯酸板（可覆盖测试笼的屋顶）
摄像机（Sony，目录号：HDR-CX560V）
注意：在弱光条件下记录鼠标行为。该型号（Sony Nightshot摄像机）配备了红外模式。
三脚架相机

注意：含有清洁空气的气瓶连接到嗅觉计。嗅觉仪调节气流（0.5升/分钟），并通过将空气通过含有丁香酚的瓶子，在洁净空气和空气之间切换气流。连接到测试笼（25 x 37 x 24厘米）的嗅觉仪可以通过墙壁上的气体口（0.5毫米直径的孔）（2厘米高度）提供清洁的空气或气味。测试笼的屋顶覆盖有透明的亚克力板（图1）。

图1.嗅觉习惯 - 抑郁测试的装置

软件

Microsoft Excel（Microsoft）

程序

考试前一天
1. 对于这个测试，应该仅使用一次鼠，以避免数据混淆，这取决于学习和记忆。在测试前五天，小鼠习惯于实验条件。实验室在实验室连续五天内，每天用乳胶手套轻轻处理每只小鼠10分钟。
在考试当天
1. 在测试室中的12小时光/暗循环的光照期间进行测试，其中弱光（<5勒克斯）用于间接照明。制备一系列用去离子水稀释的气味溶液（例如，10℃-4℃，10℃-5℃，10℃-6℃，/sup>和10 ^-7），并设置在试验室的设备部分中描述的装置（图1）。
2. 鼠标从他们的家笼转移到测试笼。
3. 为测试笼提供清洁空气，已经习惯了15分钟（图2A;习惯）。因为小鼠经常在测试笼中排出粪便和尿液多次，特别是在习惯阶段开始时，每隔5分钟（三次）用纸巾清洁地板，以防止这些气味在测试笼中扩散。 />
4. 将清洁空气连续供给测试笼3分钟（图2A;第一次试验）。在第一次和第二次试验中，使用数码摄像机记录鼠标行为。
5. 切换气流，小鼠暴露于气味3分钟（图2A;第二次试验）。
6. 被测试的鼠标返回到他们的家笼。用70％乙醇的纸巾小心清洁测试笼。向测试笼提供清洁空气5分钟，以清除嗅觉计和测试笼之间连接管的气味。使用另一只鼠标开始下一次测试。
7. 录制的视频将被分析，如下所述。
  
  图2.实验程序的模式。 A.实验程序的模式; B.调查时间定义为鼻子进入靠近气体口的2.5厘米正方形区域（蓝色虚线）的时间。

数据分析

使用录制的视频，在3分钟测试期间手动测量第一和第二次试验中的调查时间。 "调查时间"定义为鼻子进入气体口附近的2.5厘米正方形区域的时间（图2B和视频1）。我们建议调查时间通过盲目分析来衡量。第一次试验和第二次试验之间的调查时间差异以平均值±SEM计算（图3A和3B）。
使用Microsoft Excel通过Welch t 测试来计算价值，其中您单击数据分析并执行 t -test：双样本假设不平等的差异对于多个成对比较，然后根据Holm-Bonferroni方法（Holm，1979）依次评估P 值，以手动保持实验α≤0.05。
评估Holm-Bonferroni方法的公式如下：
α/（n-k + 1）
哪里，
n：测试次数，
k：对的排名数。
Holm-Bonferroni校正示例：
考虑具有未调整的P 值（p _1-4）的四个零假设（H 1-4），以显着性水平α = 0.05。 H 1：H 2：p 2 = 0.005，H 3：p ₁ 3 = 0.03，H 4：p <4> = 0.04

将 P - 值从最小到最小。
p <2>（= 0.005） p <1>（= 0.01） p <3>（= 0.03） p ₄（= 0.04）
为了计算调整后的alpha水平，将Holm-Bonferroni公式用于第一级，并将其与排名第一的P 值（p ₂）进行比较。如果 P 值较小，则拒绝第一排零假设（H ₂）。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-1 + 1）= 0.0125
0.0125 p <2>（= 0.005）。 H ₂被拒绝。
对第二级重复Holm-Bonferroni公式，并将其与第二级的P 值（p ₁）进行比较。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-2 + 1）= 0.0167
0.0167> p <1>（= 0.01）。 H ₁被拒绝。
对第三级重复Holm-Bonferroni公式，并将其与排名第三的P 值（p ₃）进行比较。
α/（n-k + 1）= 0.05 /（4-3 + 1）= 0.0250
0.0250 < p <3>（= 0.03）。 H <3>不拒绝。
当您达到第一个未被拒绝的假设时，测试停止。所有后续假设都不重要。我们得出结论，H 1和H 2被拒绝，H 3和H 4不被拒绝。 />

图3.习惯性 - 耐受性测试的样本数据。 A.在野生型小鼠中使用6.3μM丁香酚的第一次和第二次试验中的调查时间。 B.在野生型小鼠和5T4敲除（KO）小鼠中使用不同浓度的丁子香酚的第一次和第二次试验之间的调查时间差异，其中5T4编码区被LacZ （Southgate等人，2010）所取代。已知一种单程跨膜糖蛋白5T4调节嗅球中间神经元的树突状发育。在6.3μM，5T4 KO小鼠的调查时间明显短于野生型小鼠。这些结果表明，气味检测行为需要嗅球中间神经元的一个子集（参见高桥等人的详细信息，2016）。

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视频1.野生型小鼠对6.3μM丁香酚的反应

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笔记

对于测试，应使用雄性小鼠避免发情周期的影响
实验者必须限制嗅觉强烈的气味产品，并在测试过程中产生过大的噪音。因为很难彻底清除实验者的个人气味，所以建议在测试之前处理老鼠的同一个实验者在整个测试过程中执行所有的过程。
因为在这个测试中使用了未稀释的气味，所以防止测试室气味扩散很重要。使用过滤嘴在试验室外准备一系列稀释的气味溶液（步骤B1）。在测试中，首先应该使用低浓度的丁子香酚，与高浓度相比。
实验者的存在不会影响小鼠的行为。实验者必须离开测试笼。我们建议当测试阶段从专用测试室开始时，实验者就可以到那里。

致谢

该协议从先前的研究（Kobayakawa等人，2007）修改。（B）（AT），（C）（HT）和创新领域（自适应电路转换）（AT）和挑战性探索性研究（AT）的科学研究资助计划的支持日本教育，文化，体育，科技部（MEXT）。

参考文献

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Kobayakawa，K.，Kobayakawa，R.，Matsumoto，H.，Oka，Y.，Imai，T.，Ikawa，M.，Okabe，M.，Ikeda，T.，Itohara，S.，Kikusui， Mori，K。和Sakano，H。（2007）。小鼠嗅球中的先天性与学习气味处理。自然 450（7169）：503-508。
Southgate，TD，McGinn，OJ，Castro，FV，Rutkowski，AJ，Al-Muftah，M.，Marinov，G.，Smethurst，GJ，Shaw，D.，Ward，CM，Miller，CJ and Stern，PL（2010 ）。 CXCR4介导的趋化性受5T4蛋白糖蛋白调控小鼠胚胎细胞。 PLoS One 5（4）：e9982。
Takahashi，H.，Ogawa，Y.，Yoshihara，S.，Asahina，R.，Kinoshita，M.，Kitano，T.，Kitsuki，M.，Tatsumi，K.，Okuda，M.，Tatsumi， Wanaka，A.，Hirai，H.，Stern，PL和Tsuboi，A.（2016）。气味检测和歧视行为需要嗅球中间神经元的亚型。 J Neurosci 36（31）：8210-8227。 >