材料和试剂

圆形玻璃盖玻片12毫米（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：1014355112NR15） - 在高压釜循环下无菌
24孔板（Corning，Costar ^®，目录号：3524）
MDA-MB-231细胞系
MDA-MB-468细胞系
BT-549细胞系
水母发光蛋白表达质粒（Brini，2008）
明胶
胶原蛋白
Coelenterazine 0.5mM储备液，在甲醇（IS Chemical Technology，目录号：I14-2266）中 - 等分试样在50μl等分试样中。储存于-80°C。从光保存
激动剂（例如，ATP，组胺，缓激肽，咖啡因，卡巴胆碱，谷氨酸）
注意：在本协议示例中，使用100μMATP。
Milli-Q水
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：NIST200B）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M2773）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：71687）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：449709）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
Digitonin（Sigma-Aldrich，目录号：D5628或D141）
Krebs-Ringer改良缓冲液（KRB）（见食谱）
Digitonin裂解液（参见食谱）

设备

基于Windows的计算机
灌注室（Elettrofor）
低噪声光电倍增管（Hamamatsu Photonics K.K.，型号：H7360-01）
蠕动泵（Gilson's MINIPULS ^® 3）
水浴（温度控制）
光子计数单元（Hamamatsu Photonics K.K.，型号：C8855-01）

注意：设备组装如图1所示。

（1）计算机，（2）灌注室，（3）光电倍增管，（4）蠕动泵，（5）水浴，（3） 6）光子计数单元。 B.在实验过程中，灌注室放置在光电倍增管附近，防止光照。

程序

第1天
在12mm圆形玻璃盖玻片上的平板细胞，在24孔板中以30-50％汇合（约70,000个细胞/孔）并使其在其特定培养基中生长（图2）。用明胶，胶原蛋白或聚赖氨酸预处理盖玻片以增加细胞粘附性并不是强制性的，但可以推荐用于特定的细胞类型。

图2.不同的哺乳动物细胞系 MDA-MB-231（A），MDA-MB-468（B）和BT-549（C）乳腺癌细胞系约40％汇合。 br />
第2天
根据存在于亚细胞隔室中的预期游离[Ca 2+]，使用合适的水母发光蛋白表达质粒转染细胞（Brini等人，1995; Brini，2008））。根据目标细胞类型选择最佳转染/感染方案。在这个实施例中，使用水母发酵蛋白-wt和线粒体突变的水母发光蛋白（Asp119Ala）。
第3天
1. 转染24 h后，从细胞板中取出培养基。
2. 用KRB溶液洗涤细胞一次。
3. 在细胞培养37℃下，用5微升肠杆菌素在200微升KRB溶液中孵育90分钟
4. 将含有转染细胞的盖玻片转移到灌注室。将灌注室固定在光电倍增器（距离2-3mm）附近（图3）。
5. 在37℃，水浴中连续灌注细胞与KRB。激素和其他药物应加入同一解决方案
6. 打开光电倍增管并开始记录发光，理想情况下，时间间隔为1秒（放大器鉴频器的输出由连接到基于Windows的计算机的光子计数单元捕获）。
7. 一旦背景值稳定，就可以以适当的激动剂浓度刺激细胞，从而诱导内质网（ER）的Ca 2+释放。
8. 遵循发光，直到抑制Ca ^{2 +}信号。
9. 通过用洋地黄皂苷溶液裂解细胞来终止实验，从而排出剩余的水母发酵池。
10. 继续进行数据分析和校准，如下所述。
  
  图3.实验程序。 将经转染细胞包被的盖玻片从板（A）移至灌注室（B）。然后将灌注腔置于光电倍增管（C）附近。

数据分析

为了转换[Ca ^{2 +}]中的发光信号，已经开发了一种算法。需要三个变量：

每个样品在饱和[Ca 2 O 3]存在下发射的总发光量。为了计算该参数，在每个实验结束时，用含有含元甙的溶液裂解细胞（如方法部分所述），并测量残留的水母发光蛋白发出的发光。由于发光总量直接取决于水母发光蛋白的量，因此该参数考虑了转染效率的差异。
如果所有的水母发光蛋白都突然放电，则在某个时间点发射的发光即是。由于水母发光蛋白正在不断消耗，所以实验过程中L max最大值逐渐降低。在每个时间点，通过从整个实验的总光输出中减去在该点之前记录的发光来计算L max max。
L，即，即实验期间任何时刻的光子发射速率每个时间点的[Ca ^{2 +}]是L/L max max的函数（图4）。在水母发光蛋白分子中存在三个Ca 2+ 2 + 结合位点是造成光子发射速率与游离[Ca ^{2 +}]之间的陡峭关系的原因。在非常高的（> 10℃-4℃）下，发光速率与[Ca 2+> + +]无关，而非常低的[Ca 2+] >]（<10 ^-7 M）。然而，可以通过选择合适的重组水母发光蛋白构建体来扩大可以监测的[Ca ^{2 +}]的范围（图5）。
数据应从每个条件的重复绘制为Ca ^{2 +}最大峰的平均值。建议每个条件至少重复6次。此外，应显示每组样品的代表性Ca ^{2 +}迹线。

图4.代表性Ca ^{2 +}校准曲线在实验结束时，细胞裂解后，可以估计水母发光蛋白的总量和L /可以为每个数据点计算max ，从而允许将发射的光转换成游离Ca 2+浓度值。 N = 6.

图5.细胞内Ca 代表性痕迹^{2 +} 测量。 A。使用水母发光蛋白的突变同种型（Asp119Ala）在100μMATP刺激下摄取线粒体Ca 2+。使用野生型水母发光蛋白，ATP刺激后的胞质Ca 2+升高。通过加入1mM CaCl 2的Ca 2+，不含有KRB的Ca 2+，Ca 2+，Ca 2+，Ca 2+， 2 + 由激动剂刺激（ATP）引起的释放

笔记

虽然水母发光不受K ⁺和Mg ^{2 +}（其是细胞内环境中最丰富的阳离子，因此也是最可能的生理实验干扰源）两种离子都是Ca 2+激活发光的竞争性抑制剂。 pH值也会影响低于7的水母发光发光。由于这些原因，水母发光蛋白的实验需要在良好控制的pH和离子浓度条件下进行，特别是Mg ^{2 +}。
为了刺激ER的释放，应为每种细胞类型（例如，例如，ATP，组胺，缓激肽，咖啡因，卡巴胆碱，谷氨酸）选择适当的激动剂。选择取决于G蛋白偶联的质膜受体的细胞型特异性表达

食谱

Krebs-Ringer修饰缓冲液（KRB）
135 mM NaCl
5 mM KCl
1mM MgCl 2·6H 2 O
0.4mM KH 2 PO 4
1mM MgSO 4·7H 2 O→// 20 mM HEPES
用NaOH调节pH至7.4 储存于4°C
加入1mM CaCl 2和5.5mM葡萄糖，使用前新鲜
降钙素溶解液
100μM雌二醇素
10mM CaCl 2
在4°C储存最多4天

致谢

这项研究得到了欧盟的赠款（ERC mitoCalcium，第294777号给R.R.）的支持。意大利教育部，大学和研究部（PRIN至R.R.，FIRB至R.R.，Ricerca中的FIRB Futuro RBFR10EGVP_002至C.M.）; NIH（授予R.R.授予1P01AG025532-01A1）和法国肌营养不良协会AFM-Téléthon（18857至C.M.）。

参考文献

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