材料和试剂

Greiner Petri菜（60 x 15毫米）（Greiner Bio One，目录号：628161）
35 mm板（Corning，目录号：430165）
显微镜滑动75 x 25 x 1 mm（Marienfeld-Superior，目录号：10 006 12）
显微镜盖玻璃18 x 18毫米（Marienfeld-Superior，目录号：01 010 30）
C。 elegans 菌株（野生型[N2]，ife-2 [ok306] ，N2; Ex [p _ife-2 GFP ，pRF4]， ife-2
大肠杆菌OP50菌株（从Caenorhabditis遗传学中心获得）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
注意：环己酰亚胺具有显着的毒副作用。
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7778-77-0）
磷酸氢二钾（K 2 H 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7758-11-4）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106404）
胨（BD，Bacto，目录号：211677）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S6501）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）
胆固醇储备溶液（SERVA Electrophoresis，目录号：17101.01）
氯化钙脱水（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
制霉菌素储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：N3503）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：7558-79-4）
磷酸盐缓冲液（1M;无菌，见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）
M9缓冲区（见配方）

设备

解剖立体显微镜（尼康，型号：SMZ645）
紫外线交联剂（VilberLourmat，型号：BIO-LINK-BLX-E365）
荧光显微镜（ZEISS，型号：Axioskop 2 Plus）
用于制备琼脂板（高压釜，培养皿，等等）的标准设备（Sambrook和Russell，2001）
用于维护蠕虫的标准设备（铂金丝选择，孵化器，等等。）
注意：对于基本的线虫文化，维护和操纵技术参见参考文献（Epstein和Shakes，1995; Lewis和Fleming，1995; Hope，1999; Strange，2006）。关于秀丽隐杆线虫生物学的信息参见参考文献（Wood，1988; Epstein和Shakes，1995; Riddle，1997）和WormBook（ http://www.wormbook.org/）。

软件

相机控制和成像软件（Carl Zeiss，Axio Vision 3.1软件）
ImageJ图像处理软件（Rasband，WS，ImageJ，美国国立卫生研究院，Bethesda，Maryland，USA， http://rsb.info.nih.gov/ij/）（Abràmoff等人，2004）
Microsoft Office 2011 Excel软件包（Microsoft Corporation，Redmond，USA）
Prism软件包（GraphPad Software Inc.，San Diego，USA）

程序

转基因线虫生成和维护
为了实现下述协议，首先生成适当的转基因C。在所研究的细胞或组织的启动子的控制下，在感兴趣的细胞或组织中表达选择的荧光蛋白的线虫菌株。转录和翻译融合都可以用于这种方法。各种方法可用于将重组DNA引入线虫。广泛采用的技术是将DNA显微注射到妊娠成年雌雄同体动物的性腺合胞体中（Rieckher等人，2009）。
1. 在用OP50（用作线虫食品来源的大肠杆菌菌株）的60mm板上培养在感兴趣的细胞或组织中表达荧光团的转基因动物，在标准温度为20°C或其他合适的温度（取决于遗传背景和其他实验考虑因素，如所检测的动物的温度敏感性）。
2. 除非有环境控制的室或房间可用，否则荧光漂白和回收的程序在环境温度下进行。允许动物在此温度下平衡2-3小时，然后再进行光漂白。
样品制备，光漂白和回收
1. 样品制备
  该程序可以直接在板上（步骤B1a）或盖玻片（步骤B1b）进行。当检查在单个细胞中表达荧光标记的蠕虫时，移动蠕虫的照片很难分析。在这种情况下，请遵循下面的步骤B1b。对于在全局或许多组织中表达荧光标记蛋白的蠕虫，可以应用更方便的步骤B1a。我们通常避免使用麻醉剂，特别是通常使用的叠氮化钠，其阻断线粒体呼吸链，扰乱能量产生，并且可能通过阻碍蛋白质合成来干扰荧光恢复过程。为了限制动物的流动性（步骤B1a），我们发现在构建转基因品系时，使用优势的rol-6（su1006）等位基因作为共同转录标记（质粒RF4）。这种等位基因使动物滚动而不是正弦波移动，这将它们限制在板的相对较小的区域。
2. 照相漂白前照片单一动物
  使用连接到显微镜的照相机（例如Axio Cam HR，Carl Zeiss）在照相漂白之前拍摄单个动物。收集感兴趣的荧光细胞或组织的图像。应记录成像参数，如显微镜和相机设置（使用的镜头和放大镜，过滤曝光时间，分辨率，等）。
3. 执行光漂白
  使用装备有高功率光源（HBO 100; 100瓦汞弧灯;欧司朗，德国慕尼黑）的表面荧光，复合光学显微镜（例如，Axioskop 2 Plus，Carl Zeiss）和适当的激发/发射过滤器套件可以对动物进行漂白。对于本文所述的应用，10分钟的漂白漂白可以充分降低初始发射强度（达到漂白前水平的30-50％）。对于特定的荧光团，动物阶段和被检查的细胞或组织，相应地调整漂白期的光强度和持续时间。研究人员应通过实验来确定达到光漂白程度所需的适当照射持续时间，适用于不同的标本（见注1）。
  注意：
4. 荧光恢复
  光漂白后立即拍摄每只动物。收集感兴趣的细胞或组织的几个图像。将动物移动到新鲜的OP50种子NGM板上。通过在盖板的边缘处加入100μl的M9，在显微镜载玻片上将漂白动物回收，并滑出盖板。这些蠕虫也返回到OP50种子的NGM板上进行恢复。恢复时间从此开始。
  注意：所有成像参数如显微镜和相机设置（使用镜头和倍率，过滤器曝光时间，分辨率等）应按照上述步骤B2进行设置。（CRITICAL STEP）
5. 在荧光恢复后定义的时间点拍摄动物
  通过在规定的时间点拍摄动物来追踪荧光恢复。我们在连续拍摄会议之间使用1小时的间隔。可以为每个实验应用确定合适的时间间隔。收集感兴趣的细胞或组织的几个图像。如上述步骤B4所示，至关重要的是，所有成像参数（显微镜和照相机设置）与步骤B2中最初设置的成像参数保持一致（见注2）。
6. 通过在水中稀释至10mg/ml的浓度来制备放线菌酮的储备溶液。保持冷藏。在OP50接种的35mm NGM平板的顶部加入放线菌酮至琼脂体积的最终浓度为500μg/ml，并使板干燥。
  注意：
7. 在含放线菌酮的板上转移动物，并在生长温度下孵育2小时。准备如步骤B1a或B1b中的光漂白动物。在荧光恢复期间回收含放线菌酮的板中的蠕虫（见注3）

数据分析

图像采集
使用ImageJ处理在步骤B2，B4和B5中获取的图像，以确定所收集的显微照片中感兴趣的荧光细胞或组织的每个图像的平均和最大像素强度。对于每个细胞，组织或动物，应该获取图像或将其转换为8位（256灰度）的像素深度。在野生型背景或IFE-2缺陷型动物中，在存在或不存在放线菌酮的情况下，在整个体细胞组织中表达p ife-2 GFP的转基因动物的代表性图像是如图1所示
荧光强度量化
要手动分析感兴趣区域，请使用"手写选择"工具包围荧光区域。通过"分析"下拉菜单选择"测量"命令来执行像素强度分析。有时（区域连续性，高对比度），可以自动选择荧光区域。在ImageJ的"image"下拉菜单中选择"调整"，然后选择"阈值"命令。调整阈值，直到感兴趣的区域被标记为止。在"分析"下拉菜单中，选择"分析粒子"命令。通过在"显示"下拉菜单中选择"轮廓"，检查测量是否对应于感兴趣的区域。收集每个转基因品系的平均和最大像素强度值，并分组为"漂白前"，"漂白"和"恢复（n）"，其中n是光漂白后的时间间隔。
统计分析
使用Microsoft Office 2011 Excel软件包（Microsoft Corporation，Redmond，USA）和Prism软件包（GraphPad Software Inc.，San Diego，USA）进行数据的统计分析。描述恢复阶段的最佳拟合函数是通过回归分析产生的（图2）。最佳拟合线的斜率提供了回收率的量化。在所示的例子中，IFE-2缺乏的动物或用放线菌酮治疗的动物的恢复减少。

图1.体内荧光的漂白和回收。。表达p 在光动力漂白之前的野生型或IFE-2缺陷背景中，在8分钟全动物光漂白期之后，以及在5小时恢复期之后，在不存在（a）和（b）放线菌酮（500μg/ml）。比例尺=100μm

图2.在整个体细胞组织中表达p ife-2 GFP的野生型和IFE-2缺陷型动物中的荧光回收的回归分析针对所指示的遗传背景（a，野生型; b，）在恢复阶段期间获得的平均像素强度值生成 - 线）。还示出了描述每行的最佳拟合线以及R ²值的各个等式。线斜率对应于时间单位内的荧光变化的一阶导数（Δf/dt），其为回收率的量度。环己酰亚胺处理（CHX;500μg/ml）导致回收率可忽略不计（蓝线）。

笔记

光漂白不足可能是光漂白和/或不集中在感兴趣组织上的激发光持续时间不足的结果。为了克服这个问题，增加光漂白的持续时间，提高光强或者使用更高倍率和数值孔径的物镜。
没有明显的恢复（步骤B5）可能是由于过度光漂白引起的样品损伤的指示。对于所选择的时间间隔，恢复动力学也可能太慢。此外，控制荧光团表达的启动子在恢复期间可能不活跃。为了解决这些问题，减少光漂白，允许更长的恢复期或切换启动器。
由放线菌酮对光漂白的回收抑制不足可能是由于曝露不到放线菌酮而导致的。增加放线菌酮存在下动物的预孵育时间。

食谱

磷酸盐缓冲液（1M）

对于1L，在蒸馏水中溶解102.2g KH 2 PO 4和57.06g K 2 HPO 4，填充1 L.这是一个1M溶液，pH 6.0
在121℃高压灭菌15分钟，并在室温下储存

线虫生长培养基（NGM）琼脂板

混合3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨，0.2g链霉素，17g琼脂并加入900ml蒸馏水。高压灭菌在121°C 15分钟
让凉爽至55-60°C
加入1ml胆固醇储备溶液，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4，1ml制霉菌素储备溶液，25ml无菌1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0，蒸馏无菌水至1升
倾倒约8毫升培养基每培养皿，并离开巩固
将板保存在4°C直到使用

M9缓冲区

将3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5L NaCl的1L蒸馏水溶解水。高压灭菌在121°C 15分钟
冷却并加入1ml 1M MgSO 4（无菌）
在4°C存放M9缓冲液

致谢

这项工作是由欧洲研究委员会（ERC），欧洲委员会第七届支持框架计划的资助提供的。该协议已经由Syntichaki等人改编。（2007），Nature 445,922-926。

参考文献

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