材料和试剂

无菌一次性接种环
200μl移液器吸头（如：Corning，Axygen ^®，目录号：＃T-200-C）
石蜡膜（Bemis，目录号：PM996）
注射器安装的0.45μM过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
聚醚砜（PES）过滤器，0.45μM，Ø75-mM膜直径，附带500毫升瓶。使用真空泵（例如，广州喷气生物过滤，目录号：FPE404500）
1 ml和10ml无菌注射器（无针）
1 ml注射器（如：KDL医疗产品，目录号[包装上的]：7290010993604）
10 ml注射器（如：Medisposables，目录号[以书面形式出现]：9304-10/16933506093041）
无菌15-ml Falcon管（如：SPL Life Sciences，目录号：50015）
12毫升聚丙烯/聚乙二醇超速离心管（如：Beckman Coulter，目录号：331372） - 确保它们适合超速离心机的速度
注射器安装的0.22μM过滤器（Axiva Sichem Biotech，目录号：SFPV13 R）
无菌1.5ml管（1.7ml透明管）（Corning，Axygen ，目录号：＃MCT-175-C）
1 ml移液器吸头（如：Corning，Axygen ^®，目录号：＃T-1000-C）
聚苯乙烯（PS）无菌培养皿，90 x 15 mm（Miniplast Ein-Shemer，目录号：820-090-01-017）
甘油存在于-80℃的黄单胞菌属菌株 - 为了制备我们使用的这个方案。 campestris pv。从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的野蛮士（ Xcc ）33913
Difco营养琼脂（BD，目录号：21300）
注意：它含有3 g/L牛肉提取物，5 g/L蛋白胨和15 g/L琼脂，最终pH为6.8±0.2（如粉末容器上所写）。 >
头孢氨苄水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C4895） - 浓度为10mg/ml的储备溶液
无菌dH 2 O
10x磷酸缓冲盐水（PBS）缓冲液（可选）（如：Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
OptiPrep密度梯度培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D1556）
"考马斯加 - 更好的Bradford测定试剂盒"（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：23236）（可选）
脂质染料FM4-64FX（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：F34653）（可选）}
如以下协议（可选）所示，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）所需的材料和试剂： http://www.bio-protocol.org/e80 （'[Bio101] Laemmli-SDS-PAGE'）
酵母提取物粉末（EMD Millipore，目录号：61931105001730）
Bacto胰蛋白胨（BD，Bacto，目录号：211705）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：7647-14-5）
蔗糖结晶（Duchefa Biochemie，目录号：S0809）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（EMD Millipore，目录号：105886）
NaOH或HCl（为了调节pH）
蛋白胨（EMD Millipore，目录号：61930705001730）
L（+） - 谷氨酸（Acros Organics，目录号：6106-04-3）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
YEB培养基（见食谱）
PSB培养基（见食谱）
OptiPrep稀释缓冲液（见配方）

注意：（可选） - 小泡隔离过程不需要。

设备

生物罩
温度控制的孵化器振荡器（28℃），能够达到200RPM（例如：Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：MaxQ ^{TM 6000） br />}}
两个2升Erlenmeyer烧瓶
比维埃特
聚丙烯共聚物（PPCO）250毫升离心机瓶（如：Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Nalgene ^{TM PPCO离心瓶） - 确保它们是适合离心机的速度}}
高速离心机（例如，Beckman Coulter，型号：Avanti JE，目录号：369003;或Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM， RC-6，目录号：74804 ^*）和6×250ml转子（例如：Beckman Coulter，型号：JLA-16.250，目录号：363930，双锁盖;或Thermo Fisher Scientific，Sorvall ^TM型号：SLA-1500，目录号：46615 ^* [old model]） 32,000 x g
超速离心机（例如，Thermo Fisher Scientific，Sorvall TM，型号：Discovery 90SE，目录号：40130867 ^*，Kendro Laboratory Products）和a 6 x 12-ml摆动式超速离心机转子，如：Thermo Fisher Scientific，Sorvall ^{TM，型号：TH-641，目录号：54295 ^*（旧型号，Kendro Laboratory产品）或Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：TH-641，目录号：54295（新型号），速度约为175,000 x g}}
高压灭菌器
NanoSight设备（Malvern）（可选）
透射电子显微镜（可选）
SDS-PAGE所需的设备，如以下协议（可选）所示： http://www.bio-protocol.org/e80 （'[Bio101] Laemmli-SDS-PAGE'）

*旧型号的目录号。
（可选） - 泡囊隔离过程不需要。
重要提示：使用Science Gateway的离心转子速度计算器计算上述离心机速度（ http://www.sciencegateway.org/tools/rotor.htm 选项。

程序

OMV隔离前的准备
1. 准备1升YEB（初学者参见食谱）
2. 制备1升PSB（主要介质见食谱）。
3. 电镀细菌
  通过使用无菌一次性接种回路，在Difco营养琼脂平板上从板（XIII）33913（来自甘油储备液）。
  注意：建议在使用Xcc启动器前2-5天对细菌进行平铺。
4. 制作Xcc 起始器（2个无菌管，每个3ml无菌YEB）
5. 主要介质（PSB）的接种
  1. 在每个2升三角烧瓶中每500ml的PSB培养基中加入500μl头孢氨苄水合物10mg/ml（最终浓度为10μg/ml培养基）。
  2. 然后，从其中一个锥形瓶中，将1ml培养基（+头孢氨苄）转移到干净的新的比色杯中（作为分光光度计的空白）。用2层Parafilm覆盖比色皿，并将比色皿保持在4°C。
  3. 然后，向每个锥形瓶中加入300μl来自同一台起动器（必须非常多云）。
  4. 将锥形瓶放入28℃振荡器中，速度为180-200rpm，过夜（视频1）。
  注意：
6. 第二天 - 物体密度测量
  1. 然后，从其中一个锥形瓶中，将1ml培养基（+头孢氨苄）转移到干净的新的比色杯中（作为分光光度计的空白）。用2层Parafilm覆盖比色皿，并将比色皿保持在4°C。
  2. 然后，向每个锥形瓶中加入300μl来自同一台起动器（必须非常多云）。
  3. 将锥形瓶放入28℃振荡器中，速度为180-200rpm，过夜（视频1）。
  注意：
7. 第二天 - 物体密度测量
  1. ...
    
    - ！ - [if！IE]> - ><！ - <！[endif] - > <！ - flashid2160v183结束 - >
  2. 然后，通过0.45μm膜直径（由真空泵操作）的0.45微米PES过滤器过滤上清液。
    可选：可以通过这种过滤器过滤整个1升培养物;因此，您可以将其连接到1升瓶（如果过滤器适合）。过滤的上清液可以在4℃下储存1天。
8. 造粒囊泡
  1. 将过滤的上清液倒入250ml瓶中，并将其离心。 32,000 x g 2 h，4°C。小泡将从转子中心向外的方向沉淀（图1）。可以使用的转子：SLA-1500（Sorvall），JLA-16.250（Beckman-Coulter）（视频3）。
  2. 弃去上清液，重新悬浮沉淀的囊泡，使用5-8毫升无菌dH 2 O，通过压片法。
    可选：通过0.45-μM（由10ml注射器操作）将重悬的囊泡过滤到无菌的15-ml Falcon管中，以便将其保持在4℃下几天。必须在生物罩上完成。
    
    图1.具有半透明黄色的颗粒状OMV可以在管的底部（每个管的标记区域内）看到，大约在离心后。 32,000 x g 2小时
    
    <！ - flashid2160v184开始 - >
    视频3.起泡囊泡
    
    <！ - flashid2160v184结束 - >
9. 超速离心
  1. 将从前一步骤中重悬的囊泡倒入两个12-ml超离心管中，并使用无菌dH 2 O以填充管的剩余体积。
  2. 超重离心重悬的囊泡， 175,000 x g，在4℃下1小时35分钟。可以使用的转子：Sorvall TH-641。可以使用的超速离心机：Sorvall Discovery 90SE。小泡将在管的底部沉淀（图2，视频4）。
    
    图2.在12 ml管底部看到的颗粒状OMV，超声离心后， 175,000 x g 1小时35分钟
    
    <！ - flashid2160v185开始 - >
    视频4.超速离心
    
    <！ - flashid2160v185结束 - >
10. 最终重新悬浮和储存
11. 密度梯度离心：为了进一步纯化OMV，对于需要高纯化样品（例如LC-MS/MS中的蛋白质分析）的分析，需要密度梯度离心步骤（Chutkan ，2013）。
OMV准备质量和数量检查
1. 检查制剂是否无菌
  1. 用Difco营养琼脂吸取10μlOMV制剂，放开直至10μl滴入。必须在生物罩上完成。
  2. 然后，将板放在28℃的培养箱中2-5天，并检查是否形成了放置滴液的菌落。
2. OMV的量化
3. 透射电子显微镜（TEM）
  TEM可用于观察OMV（图4）并估算大小范围和浓度以及检查制剂的纯度。
  
  图4.在无菌dH 2 O中以1:20的比例稀释的OMV制剂的TEM图像。 OMV直径可能在20-250之间。比例尺位于左下角。
4. SDS-PAGE
  为了获得OMV的蛋白质货物的轮廓，运行OMV样品，其在含有十二烷基硫酸钠（SDS）和二硫苏糖醇（DTT）/β-巯基乙醇的样品缓冲液中在蛋白质凝胶上变性。如果您正在寻找与OMV相关的特定蛋白质，您还可以运行Western印迹或斑点印迹测定。 SDS-PAGE也是比较从不同细菌分离的OMV的蛋白质谱的方法

数据分析

也许从细菌培养中纯化OMV的主要挑战之一就是证明其纯度。由于OMVs是从培养上清液中纯化的，所以必须考虑表面污染的风险，细菌细菌附属物如鞭毛，皮毛，菌毛等。仔细检查多个TEM网格样品，并确定是否将这些附属物与OMV共同纯化，以确保纯度。 OMV制剂的另一种可能的污染物是破碎的细胞碎片和大的蛋白质复合物。为了尽可能减少破碎细胞污染的机会，在细胞死亡和断裂不太可能发生的对数生长阶段应该收获培养物。此外，我们强烈建议对任何下游研究进行密度梯度离心步骤，特别是对蛋白质组学等分析研究，以避免从上清液中共同纯化大蛋白质或蛋白质复合物。

食谱

YEB（1 L，初学者）

添加：
5克酵母提取物粉末 10克Bacto胰蛋白胨
5克NaCl
5克蔗糖结晶
5g MgSO 4·7H 2 O→// 至900ml的dH O O
使用NaOH或HCl调节pH至7.3 注意：不要在测量pH时加热。
通过加入更多的dH 2 O使1升，并在121℃下高压灭菌20分钟

PSB（1 L，主要介质）

添加：
10g蛋白胨
10g蔗糖结晶
1克L（+） - 谷氨酸至900ml的dH O O
搅拌时稍微加热可能有助于溶解组分，但不是强制性的。关闭热量，并将烧杯转移到另一个较冷的搅拌器上
使用NaOH或HCl调节pH至7.3 注意：请勿在检查pH值时加热。
添加更多dH ₂ O以达到1L
将介质通过烧杯和量筒之间的介质混合
将培养基分成两个2-L锥形瓶（每个500ml），121℃高压灭菌20分钟。

OptiPrep稀释缓冲液（1升）

添加：
8.5克NaCl
2.38克HEPES
到约750毫升dH 2 O在烧杯中
用NaOH调节pH至7.4 注意：请勿在检查pH值时加热。
带有dH 2 O的1 L，用0.45μM过滤器（由真空泵操作）进行过滤灭菌
建议：将缓冲液保持在4°C

致谢

在巴哈尔实验室的工作得到了德黑两国科学研究与发展基金会（GIF），第I-2392-203.13/2015号授权和以色列科学基金会授予的第2025/16号资助。我们还要感谢我们的实验室成员，S. Burdman的实验室，M. Levy的实验室和N. Sela，在实验中的协作，以及M. Mawassi的实验室V.Gaba的实验室，A. Dombrovsky的实验室和S. Manulis-Sasson的实验室，用于实验所需的一些设备。

参考文献

Chutkan，H.，Macdonald，I.，Manning，A.and Kuehn，MJ（2013）。细菌外膜囊泡的定性和定性制剂。方法Mol Biol 966：259-272。
Goel，AK，Rajagopal，L。和Sonti，RV（2001）。与xanthomonas oryzae pv的 aroE 基因突变相关的颜料和毒力缺陷。 oryzae 。 Appl Environ Microbiol 67（1）：245-250。
Munhoz，CF，Weiss，B.，Hanai，LR，Zucchi，MI，Fungaro，MH，Oliveira，AL，Monteiro-Vitorello，CB和Vieira，ML（2011）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21077774"target ="_ blank">在百香果中检测黄单胞菌轴突的基因多样性和基于PCR的方法 植物病理学 101（4）：416-424。