材料和试剂

ChromaSpin + TE-1000色谱柱（Takara Bio，Clontech，目录号：636079）
Falcon ^®聚苯乙烯24孔组织培养微孔板（Corning，Falcon ^{®，目录号：353226）}
薄壁PCR管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：AB1182）}
Falcon ^®试管与细胞过滤器卡帽（Corning，Falcon ^{®，目录号：352235）}
聚苯乙烯96孔组织培养微孔板，平底（Corning，Falcon ^{®，目录号：353916）}
1.75 ml微量离心管
注意：制造商无所谓。
可选：10厘米组织培养皿（康宁，目录号：353003）
人类细胞系，如HEK293
表达感兴趣的引导RNA或RNA的载体和Cas9（例如，Addgene，目录号：42230）
双链DNA模板，优选质粒
在每个寡核苷酸的5'末端含有三个硫代磷酸酯键用于PCR扩增模板的DNA寡核苷酸
具有相关缓冲液的高保真，平端产生DNA聚合酶：Phusion（New England Biolabs，目录号：E0553S）或Q5（New England Biolabs，目录号：M0491S）是该方案唯一可接受的聚合酶
10mM dNTPs（New England Biolabs，目录号：N0446S）
MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN，目录号：28004）
FastDigest I（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：FD1703）
无核酸酶的水
转染试剂如FuGENE HD（Promega，目录号：E2311）
Opti-MEM I介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985062）
NucBlue ^®固定细胞染色ReadyProbes ^®试剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：R37606）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
0.05％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25300054）}
DMEM，高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11965092）}
胎牛血清（FBS）
0.5M EDTA，pH8.0（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15575020）}
成长媒介（见食谱）
FACS媒体（见配方）

设备

PCR热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1861096）
组织培养罩，B2型生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：1300 Series Class II）}
孵育器（37℃和5％CO 2）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，Sup。TM，型号：Series 8000）（例如， br />
微量离心机（例如，Eppendorf，型号：5424）
FACSAria II细胞分选机（BD）
血细胞计数器（Neubauer chamber）或等效方法

程序

敲入钝性结扎盒的产生
1. 根据制造商的说明书使用1ng双链DNA模板和50μl的最小反应体积设置至少8个PCR反应。使用适当的参数在热循环仪上进行PCR
2. PCR后，使用MinElute PCR纯化试剂盒根据制造商的说明进行反应并纯化产物。在20μl提供的EB缓冲液中洗脱。
3. 为了除去携带的质粒，使用FastDigestIp进行限制性消化。使用30μl的反应体积和以下热循环仪方案：
  37°C 1小时
  80°C 10分钟
  12°C无限远
4. 使用无核酸酶的水将反应物加入到100μl中，并使用CHROMASpin + TE-1000色谱柱根据制造商的说明书从消化物中纯化盒产品（见注1）。
敲入钝性结扎
1. 转染前一天，在500μl生长培养基中的24孔板中每孔铺板150,000至500,000个HEK293细胞，并置于组织培养箱中。
2. 在转染当天，使用100-200ng纯化的盒，0.5-1.5μg的引导RNA + Cas9载体，FuGENE HD试剂在组织培养罩的微量离心管中组装转染反应3:1试剂与DNA的比例，Opti-MEM I至50μl。一式三份进行一次反应，确保包括阴性（单独转染试剂）对照。短暂旋转反应，室温孵育30分钟
3. 30分钟后，从细胞吸出培养基，并用500μl新鲜生长培养基代替。从每个孔中取出50μl的培养基。然后，将转染反应滴加到各孔中，然后轻轻旋转平板混匀。将板放在组织培养箱中
4. 转染后两天，胰蛋白酶消化细胞（参见注释2），在微量离心管中收获，在微量离心机中以300×g离心5分钟，并吸出上清液。然后，将颗粒重新悬浮在200μl补充有NucBlue固定细胞染色ReadyProbes 试剂的FACS培养基中，并通过Falcon试管的过滤器过滤细胞悬浮液。将管放在冰上，防止光照。
5. 使用FACSAria II流式细胞仪，将单个细胞克隆到含有200μl生长培养基的96孔板的各个孔中。克隆后将板简单离心（300×g），并将其置于组织培养箱中5天而不受干扰（见注3）。请注意，这种克隆过程可以通过荧光报告员在盒式磁带或Cas9表达载体中大大方便（见注4）。
6. 5天后，定期用200μl新鲜培养基更换旧培养基，直到菌落足够大才能通过。
7. 当第一次传代菌落时，将每个菌落中的一半细胞保留用于诊断PCR，以鉴定哪个菌落含有所需的敲入事件。

数据分析

原始文献（Geisinger等人，2016年）中可以找到流式图和转染细胞的平均百分比以及来自成功敲入等位基因HEK293和人诱导多能干细胞的测序数据的实例。链接到纸）。另外，在原始的论文中可以找到程序的图表，以及敲入盒的例子。

笔记

或者，步骤A2-A4可以用凝胶电泳代替，随后进行凝胶提取
为了细胞培养，首先吸出培养基。然后用1ml PBS洗涤，然后用200μl的0.05％胰蛋白酶-EDTA洗涤。将组织培养箱中的细胞在37℃下放置10分钟。从培养箱中取出细胞，然后在收获前加入800μl生长培养基
作为克隆单个细胞的替代方案，可以使用连续稀释电镀，注意可能需要更多的时间和更多的平板来获得所需的克隆。
如果使用荧光报告基因或耐药基选择，则可将转染细胞分选成一个池，稀释地铺在生长培养基上的10cm组织培养皿上以产生菌落。

食谱

成长媒体
450毫升高糖DMEM
50ml FBS
FACS媒体
488毫升PBS
10 ml FBS
2 ml 0.5 M EDTA

致谢

该协议最初作为Geisinger等人的一部分发布。（2016）。作者希望感谢Calos实验室的过去成员进行有益的讨论。特别感谢斯坦福共享FACS设备和NIH S10共享仪器授权S10RR025518-01和加利福尼亚再生医学研究所TR4-06711资助。

参考文献

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Geisinger，JM，Turan，S.，Hernandez，S.，Spector，LP和Calos，MP（2016）。＆lt; a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih .gov / pubmed / 26762978"target ="_ blank"> 体内通过CRISPR / Cas9促进的非同源末端连接进行平端克隆。核酸Res < / em> 44（8）：e76。
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